dPCR에 대한 초보자 가이드

단계 1: 준비 및 로딩

첫 번째 단계로, 검체를 준비하는 것이 중요합니다. DNA 양과 순도를 측정할 것을 권장합니다. 공정에 따라, 검체를 또한 여러 희석 수준으로 검사할 수 있습니다. PCR 억제제 양이 많지 않은 순수한 검체를 사용하는 것이 좋습니다. 검체 준비에 관한 자세한 정보는 QIAcuity공정 가이드를 참조하세요.

그 다음으로, dPCR 매개변수 – 프라이밍, 사이클링 및 이미징 프로필, 반응 혼합물, 샘플 및 대조물질, 플레이트 레이아웃을 정의하여 QIAcuity Software Suite에서 실험을 생성합니다. 플레이트를 정의하고 나면 실행 준비가 완료된 것입니다. QIAcuity PCR 마스터 혼합물과 검체, 프라이머, RNase가 없는 물 및 제한 효소(선택 사항)를 혼합하여 사전 플레이트에서 반응 혼합물을 준비합니다. 최종 반응 부피는 사용한 QIAcuity Nanoplate에 의해 좌우됩니다. 그 다음 준비한 반응 혼합물을 나노플레이트로 피펫팅할 수 있습니다. 증발 및 오염을 방지하기 위해 나노플레이트를 제대로 밀봉해야 합니다. 롤러를 사용하여 플레이트 전체 구조에 포일을 고정합니다. 좋은 충전 결과를 얻기 위해서는 수동 롤링으로 플레이트 밀봉을 올바르게 고정하는 것이 중요합니다. 플레이트를 측면 가장자리나 트레이로 잡고 흔들거나 돌리지 않고 순조롭게 QIAcuity로 운반하여 반응 혼합물이 투입 웰의 아랫부분에 있도록 하는 것이 매우 중요합니다. 기기와 제품군이 연결되면 모든 모듈을 사용할 준비가 된 것이며 플레이트를 로딩하고 시작할 수 있습니다.

단계 2: 설정 실행 및 증폭

플레이트를 로딩하면, 기기가 슬롯을 파란색으로 강조 표시하고 바코드를 스캔합니다. 제어 소프트웨어에서 이전에 설정한 선호되는 실험을 플레이트에 연결할 수 있으며, 프라이밍, 사이클링 및 이미징 프로필이 정의되고 실행이 시작됩니다.

먼저, 프라이밍/롤링 모듈에서 플레이트가 처리됩니다. 이 단계에서 각 웰의 반응 혼합물은 수천 개의 작은 개별 반응으로 분획 됩니다. 그 다음 서모사이클러에서 PCR을 실행합니다. 하나 또는 다른 분획 내의 적절한 템플릿 물질로 인해 이미징 동안 검출되는 양성 형광 신호가 생깁니다. 이미지는 이미지 처리를 위해 QIAcuity Software Suite로 전송됩니다.

기기 화면이나 Software Suite에서 현재 플레이트 상태를 확인할 수 있습니다.

단계 3: 결과 분석

분석하려면 다음 중 하나를 선택합니다: 절대 정량화, 돌연변이 검출, 유전자 편집, 복제수 변이 또는 유전자 발현. 절대 정량화 분석의 경우 선호하는 웰 그리고 표적 또는 검출 채널 중 하나를 선택하기만 하면 됩니다. 목록 보기에는 농도, 신뢰 구간, 그리고 유효한 양성 및 음성 분획이 표시됩니다. 열 지도 보기는 기준 채널 옆에 표적 채널을 표시합니다. 히스토그램, 1D 산점도 또는 2D 산점도 중 하나를 사용하여 임계값 설정을 변경합니다. 변경된 임계값을 기준으로 한 결과를 얻으려면 “다시 계산”을 클릭합니다.