QuantiTect Reverse Transcription Kit

遺伝子発現解析のための高感度な2ステップリアルタイムRT-PCR用cDNAの迅速合成

  • わずか20分でcDNA合成およびgDNA除去を完了
  • 低発現量の転写物からでも高収量でcDNAを合成
  • 転写物の5'および3'領域からでもcDNAを合成
  • RNA特異的なプライマーやプローブのデザインは不要

QuantiTect Reverse Transcription KitはゲノムDNA除去を組み込んだcDNA合成を迅速かつ簡便な方法で実現します。RNAサンプル中のゲノムDNAコンタミはgDNA Wipeout Bufferで効率的に除去されます。Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer、画期的なRT Primer Mixにより、迅速かつ効率的な逆転写反応に必要な全ての成分が提供されます。合成されたcDNAはリアルタイムPCRでの使用に至適化され、mRNA転写物のどの領域の標的も確実に定量できます。

製品名 Cat. no. List price:
QuantiTect Rev. Transcription Kit (50)
For 50 x 20 µl reactions: 100 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 50 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 200 µl 5x Quantiscript RT Buffer, 50 µl RT Primer Mix, 1.9 ml RNase-Free Water
205311
¥40,500
QuantiTect Rev. Transcription Kit (200)
For 200 x 20 µl reactions: 4 x 100 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 4 x 50 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 4 x 200 µl 5x Quantiscript RT Buffer, 4 x 50 µl RT Primer Mix, 4 x 1.9 ml RNase-Free Water
205313
¥142,000
QuantiTect Rev. Transcription Kit (400)
For 400 x 20 µl reactions: 800 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 400 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 1.6 ml 5x Quantiscript RT Buffer, 400 µl RT Primer Mix, 8 x 1.9 ml RNase-Free Water
205314
¥257,000

QuantiTect Reverse Transcription Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


  • Main Image Navi
迅速で簡便なcDNA合成|効果的なゲノムDNA除去による正確なリアルタイムRT-PCR|12.5 kbの転写物の5'領域における標的を高感度で検出|より高い感度の2ステップリアルタイムRT-PCR|
QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いれば、ゲノムDNA除去とcDNA合成はわずか20分で完了する。両反応とも同一のインキュベーション温度で行なうことができ、マスターミックスによるセットアップができるため、操作は迅速かつ簡便である。一方、Supplier Iのキットを用いた精製法ではピペッティングステップが多いためにより多くのマニュアルでの作業が必要となり、インキュベーション温度も頻繁に変更しなければならず、時間と手間がより多くかかる。|逆転写酵素あり(+RT)あるいはなし(–RT)のβ-actinの2ステップリアルタイムRT-PCR解析。cDNAは100 ngのトータルRNAから合成し、QuantiTect SYBR® Green PCR Kitを用い、LightCycler 2.0上でリアルタイムPCRをduplicateで行なった。β-actinに特異的なプライマーはmRNAおよびゲノムDNA配列をいずれも検出。テンプレートなしのコントロール反応も行なった(緑)。[A] QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いてRT反応を行なった。–RTの赤色の線が上昇しないのは残留ゲノムDNAが効率的に除去されたことを示唆している。[B] Supplier Iのキット(Enzyme SIII)を用いてRT反応を行なった。紫色の–RTの線は、残留ゲノムDNAの増幅があることを示唆している。|マウスdystrophin遺伝子の5'領域に局在する標的(poly-A部分から約12.5 kbアップストリーム)の2ステップリアルタイムRT-PCR。マウス精巣から精製したトータルRNAは、QuantiTect Reverse Transcription KitおよびSupplier IとSupplier Rの逆転写酵素により逆転写した。同一量のtriplicate逆転写反応は、LightCyclerシステム上でリアルタイムPCRにより解析した。エラーバーは各triplicateの標準偏差を示している。他の2つのキットと比較し、QuantiTect Reverse Transcription Kitははるかに多量のcDNAを作成し(低いCT値で示される)、リアルタイムRT-PCRの再現性が高くなった(エラーバーが小さいことで示される)。RFU:相対的蛍光単位

(データ提供:Dr. Andrej-Nikolai Spiess, Department of Molecular Andrology, University Hospital Hamburg, Germany)。|[A] TGFB2(低い発現量)と[B] IL8(より高い発現量)の2ステップリアルタイムRT-PCR解析。PAXgene Blood RNAシステムを用いてヒト全血からトータルRNAを精製した。QuantiTect Reverse Transcription Kit、Supplier AIIのキット、またはSupplier Iのキットを用いて 1 µg RNA からcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、QuantiTect Probe PCR KitおよびTGFB2またはIL8用QuantiTect Gene Expression Assaysを用い、ABI PRISM 7900において、duplicateで行なった。QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いた場合にTGFB2のCT値が最低値であったことは、発現量の低い遺伝子でさえも効率的に逆転写し、リアルタイムPCRで高感度で検出できることを証明している。|

パフォーマンス

QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いることにより、RNAサンプル中に混入しているゲノムDNAはユニークなgDNA Wipeout Bufferで効率的かつ迅速に除去されます(図"効果的なゲノムDNA除去による正確なリアルタイムRT-PCR")。ゲノムDNAの排除は正確な遺伝子発現結果を得るために極めて重要であり、RNA特異的プライマーまたはプローブのデザインは必ずしも可能とは限りません。gDNA Wipeout Bufferを用いると、RNAサンプルの精製中あるいは精製後に別途にDNase分解を行なう必要がないため、時間および経費を節約できます。 

Quantiscript RT Bufferと組み合わせて用いることにより、Quantiscript Reverse Transcriptaseの高いRNAアフィニティーはどのようなRNAテンプレートからも高い収量でcDNAを合成できます(表"より少量の転写物からより高いcDNA収量")。GC含有率が高いあるいは複雑な二次構造を持つ逆転写が困難なテンプレートでさえも問題なく逆転写できます。

より少量の転写物からより高いcDNA収量
IL12AのCT
(低発現量)
IL1RNのCT
(高発現量)
スタートRNA(ng) QIAGEN Supplier AII QIAGEN Supplier AII
1000 30.9 32.0 23.1 24.9
100 34.2 35.4 26.3 26.6
10 37.8 46.8 29.7 30.3
1 非検出 非検出 32.4 34.5
種々のスタートRNA量を用いたIL12AとIL1RNの2ステップリアルタイムRT-PCR解析。トータルRNAからQuantiTect Reverse Transcription Kit あるいはSupplier AIIのキットを用いて逆転写反応を行なった。合成したcDNAをQuantiTect Probe PCR KitとIL12AあるいはIL1RN用QuantiTect Gene Expression Assayを用いてABI PRISM 7900上で解析した。QIAGENキットでのより低いCT値は(特に発現量が中等度のIL12A遺伝子、太字)、より高いcDNA収量を示唆している。N.D.:検出されなかった。

RT Primer Mixには全てのRNA転写物の5'領域も含むあらゆる領域からcDNA合成を実現する特別に至適化されたoligo-dTオリゴ-dTとランダムプライマーのミックスが含まれています(図"12.5 kbの転写物の5'領域における標的を高感度で検出")。他社のキットと比較して、QuantiTect Reverse Transcription Kitは増幅する標的領域が転写物のどこに局在しているかに関係なく、リアルタイムPCR解析用のcDNAテンプレートを高い収量で合成し、発現量が少ない遺伝子の検出感度を上昇させます(図"より高い感度の2ステップリアルタイムRT-PCR")。また、QuantiTect Reverse Transcription Kitは、再現性のより高いリアルタイムRT-PCRを実現します。

原理

QuantiTect Reverse TranscriptaseはOmniscriptとSensiscript Reverse Transcriptaseのブレンドで、RNAに対して高いアフィニティーを有し、幅広いRNA量(10 pg~1 µg)からcDNA合成が可能です。他社のキットと比較して、QuantiTect Reverse Transcription Kitは増幅する標的領域が転写物のどこに局在しているかに関係なく、リアルタイムPCR解析用のcDNAテンプレートを高い収量で合成します。GC含有率が高いあるいは複雑な二次構造を持つ逆転写が困難なテンプレートでさえも問題なく逆転写できます。また、QuantiTect RT BufferはリアルタイムPCRバッファーと互換性があるようにも至適化されています。

リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現アッセイで正確な結果を得るためには、cDNAのみを増幅し検出することが重要です。ゲノムDNAによるアッセイへの悪影響はエクソン/エクソン境界にまたがるプライマーやプローブをデザインすることにより避けることができます。しかし、この方法が不可能な場合もあり(例えばシングルエクソン遺伝子からのcDNA)、スタートとなるRNAサンプルがゲノムDNAを含まないことが必須です。QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いることにより、RNAサンプル中に混入しているゲノムDNAはユニークなgDNA Wipeout Bufferで効率的かつ迅速に除去されます。RNAサンプルの精製中あるいは精製後に別途にDNase分解を行なう必要がないため、時間および経費を節約できます。RNA特異的なプライマーやプローブのデザインも不要です。 

QuantiTect Reverse Transcriptase Kitの構成
構成利点
gDNA Wipeout BufferリアルタイムRT-PCRのみでRNAを検出
Quantiscript Reverse Transcriptase幅広いRNA量(10 pg~1 µg RNA)の使用
高感度
Quantiscript RT Buffer増幅困難なテンプレートの読み取り
RT Primer Mix転写物の全ての領域、5'領域からもcDNAを合成
操作手順

QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いれば、ゲノムDNA除去とcDNA合成はわずか20分で完了します(フローチャート"迅速で簡便なcDNA合成")。両反応とも同一のインキュベーション温度で行なうことができ、マスターミックスによるセットアップができるため、操作は迅速かつ簡便です。

QuantiTect Reverse Transcription Kitには、迅速なcDNA合成に必要なものが全て含まれています。精製したRNAはgDNA Wipeout Bufferで短時間インキュベートし、混入したゲノムDNAを効率的に除去します。他の方法と比較し、逆転写反応において、Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer、RT Primer Mixで調製したマスターミックスを用い、RNAサンプルを直接使用します。Quantiscript Reverse Transcriptaseを用いると、複雑な2°構造でもRNAは低温で転写され、RNAは分解されません。反応全体は42℃で起こり、95℃で不活化されます。RNA変性、プライマーアニーリング、RNase H分解の追加ステップは必要ありません。

アプリケーション

QuantiTect Reverse Transcription Kitはレーザーマイクロダイセクションサンプルや組織生検を含む全ての種類のスタートサンプルから感度および効率の良いリアルタイムRT-PCRを実現します。

You are not authorized to download the resource

キットハンドブック
2
For cDNA synthesis with integrated removal of genomic DNA contamination For use in real-time two-step RT-PCR
詳細を表示
ゲノムDNA除去を組み込んだcDNA合成;
2ステップ・リアルタイムRT-PCR用
詳細を表示
クイックスタートプロトコール
1
MSDS
1
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
表示
画像
Fast and convenient cDNA synthesis.
迅速で簡便なcDNA合成

QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いれば、ゲノムDNA除去とcDNA合成はわずか20分で完了する。両反応とも同一のインキュベーション温度で行なうことができ、マスターミックスによるセットアップができるため、操作は迅速かつ簡便である。一方、Supplier Iのキットを用いた精製法ではピペッティングステップが多いためにより多くのマニュアルでの作業が必要となり、インキュベーション温度も頻繁に変更しなければならず、時間と手間がより多くかかる。

Effective genomic DNA removal for accurate real-time RT-PCR.
効果的なゲノムDNA除去による正確なリアルタイムRT-PCR
逆転写酵素あり(+RT)あるいはなし(–RT)のβ-actinの2ステップリアルタイムRT-PCR解析。cDNAは100 ngのトータルRNAから合成し、QuantiTect SYBR® Green PCR Kitを用い、LightCycler 2.0上でリアルタイムPCRをduplicateで行なった。β-actinに特異的なプライマーはmRNAおよびゲノムDNA配列をいずれも検出。テンプレートなしのコントロール反応も行なった(緑)。[A] QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いてRT反応を行なった。–RTの赤色の線が上昇しないのは残留ゲノムDNAが効率的に除去されたことを示唆している。[B] Supplier Iのキット(Enzyme SIII)を用いてRT反応を行なった。紫色の–RTの線は、残留ゲノムDNAの増幅があることを示唆している。
Senstitive detection of a target at the 5' region of a 12.5 kb transcript.
12.5 kbの転写物の5'領域における標的を高感度で検出

マウスdystrophin遺伝子の5'領域に局在する標的(poly-A部分から約12.5 kbアップストリーム)の2ステップリアルタイムRT-PCR。マウス精巣から精製したトータルRNAは、QuantiTect Reverse Transcription KitおよびSupplier IとSupplier Rの逆転写酵素により逆転写した。同一量のtriplicate逆転写反応は、LightCyclerシステム上でリアルタイムPCRにより解析した。エラーバーは各triplicateの標準偏差を示している。他の2つのキットと比較し、QuantiTect Reverse Transcription Kitははるかに多量のcDNAを作成し(低いCT値で示される)、リアルタイムRT-PCRの再現性が高くなった(エラーバーが小さいことで示される)。RFU:相対的蛍光単位

(データ提供:Dr. Andrej-Nikolai Spiess, Department of Molecular Andrology, University Hospital Hamburg, Germany)。

Higher sensitivity in real-time two-step RT-PCR.
より高い感度の2ステップリアルタイムRT-PCR
[A] TGFB2(低い発現量)と[B] IL8(より高い発現量)の2ステップリアルタイムRT-PCR解析。PAXgene Blood RNAシステムを用いてヒト全血からトータルRNAを精製した。QuantiTect Reverse Transcription Kit、Supplier AIIのキット、またはSupplier Iのキットを用いて 1 µg RNA からcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、QuantiTect Probe PCR KitおよびTGFB2またはIL8用QuantiTect Gene Expression Assaysを用い、ABI PRISM 7900において、duplicateで行なった。QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いた場合にTGFB2のCT値が最低値であったことは、発現量の低い遺伝子でさえも効率的に逆転写し、リアルタイムPCRで高感度で検出できることを証明している。