QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いれば、ゲノムDNA除去とcDNA合成はわずか20分で完了する。両反応とも同一のインキュベーション温度で行なうことができ、マスターミックスによるセットアップができるため、操作は迅速かつ簡便である。一方、Supplier Iのキットを用いた精製法ではピペッティングステップが多いためにより多くのマニュアルでの作業が必要となり、インキュベーション温度も頻繁に変更しなければならず、時間と手間がより多くかかる。|逆転写酵素あり(
+RT)あるいはなし(
–RT)のβ-actinの2ステップリアルタイムRT-PCR解析。cDNAは100 ngのトータルRNAから合成し、QuantiTect SYBR
® Green PCR Kitを用い、LightCycler 2.0上でリアルタイムPCRをduplicateで行なった。β-actinに特異的なプライマーはmRNAおよびゲノムDNA配列をいずれも検出。テンプレートなしのコントロール反応も行なった(緑)。
[A] QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いてRT反応を行なった。
–RTの赤色の線が上昇しないのは残留ゲノムDNAが効率的に除去されたことを示唆している。
[B] Supplier Iのキット(Enzyme S
III)を用いてRT反応を行なった。紫色の
–RTの線は、残留ゲノムDNAの増幅があることを示唆している。|マウスdystrophin遺伝子の5'領域に局在する標的(poly-A部分から約12.5 kbアップストリーム)の2ステップリアルタイムRT-PCR。マウス精巣から精製したトータルRNAは、QuantiTect Reverse Transcription KitおよびSupplier IとSupplier Rの逆転写酵素により逆転写した。同一量のtriplicate逆転写反応は、LightCyclerシステム上でリアルタイムPCRにより解析した。エラーバーは各triplicateの標準偏差を示している。他の2つのキットと比較し、QuantiTect Reverse Transcription Kitははるかに多量のcDNAを作成し(低いC
T値で示される)、リアルタイムRT-PCRの再現性が高くなった(エラーバーが小さいことで示される)。
RFU:相対的蛍光単位
(データ提供:Dr. Andrej-Nikolai Spiess, Department of Molecular Andrology, University Hospital Hamburg, Germany)。|[A] TGFB2(低い発現量)と[B] IL8(より高い発現量)の2ステップリアルタイムRT-PCR解析。PAXgene Blood RNAシステムを用いてヒト全血からトータルRNAを精製した。QuantiTect Reverse Transcription Kit、Supplier AIIのキット、またはSupplier Iのキットを用いて 1 µg RNA からcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、QuantiTect Probe PCR KitおよびTGFB2またはIL8用QuantiTect Gene Expression Assaysを用い、ABI PRISM 7900において、duplicateで行なった。QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いた場合にTGFB2のCT値が最低値であったことは、発現量の低い遺伝子でさえも効率的に逆転写し、リアルタイムPCRで高感度で検出できることを証明している。|