QuantiTect Probe RT-PCR Kit

配列特異的プローブを用いた遺伝子発現解析用1ステップリアルタイム定量RT-PCR

  • 低コピーターゲットの高感度な検出
  • テンプレートの数段階の対数希釈範囲で正確な定量
  • ほとんどのリアルタイムサイクラー上で、ほとんどの配列特異的なプローブに対応
  • 反応およびサイクリング条件の至適化不要

QuantiTect Probe RT-PCR Kitsは配列特異的なプローブを用いて1ステップリアルタイムRT-PCRで高感度にRNAターゲットを定量します。ホットスタートと即使用可能なマスターミックス中の独自のPCRバッファーシステムの組み合わせは、至適化なしにほとんどのサイクラーで高感度なqRT-PCRを実現します。dNTP MixはdUTPを含み、オプションのUNG処理ができます。マスターミックスは2~8℃で保存でき、簡便に取り扱えます。

製品名 Cat. no. List price:
QuantiTect Probe RT-PCR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix, 100 µl QuantiTect RT Mix, 2 x 2 ml RNase-Free Water
204443
¥83,500
QuantiTect Probe RT-PCR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix, 0.5 ml QuantiTect RT Mix, 20 ml RNase-Free Water
204445
¥341,000

QuantiTect Probe RT-PCR Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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1ステップRT-PCR|特異性の高い増幅|幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現|2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - A|2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - B|特異的なプライマーアニーリング|
QuantiTect Probe RT-PCR Kit は面倒で時間のかかる反応条件の至適化が不要。プライマー、プローブ、RNA テンプレートを即使用可能なRT-PCRマスターミックスに添加するだけで、どのリアルタイムサイクラーでも反応を開始することができる(表"QuantiTect Probe RT-PCR Kit の成分"も参照)。|他社のDNAポリメラーゼと比較した結果、ユニークなバッファーと組み合わせたHotStarTaq DNA Polymeraseのみが497 bp フラグメントを特異的に増幅させた(1 µgのヒトゲノムDNAに添加した50 コピーのHIV-pol-遺伝子コンストラクトからのフラグメント)。M:マーカー。|ヒト28S rRNAに特異的なプライマーおよび HEX標識プローブとQuantiTect Probe RT-PCR Kitを用いて、HeLa細胞RNAの10倍連続希釈液(100 ng~1 pg)をABI PRISM 7900 でduplicateで解析した。テンプレートを106倍希釈した溶液で高いPCR効率が得られた。|IL1R2(interleukin 1 receptor, type II)に特異的なプライマーおよび FAM標識プローブを用いて、白血球から調製したcDNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。QuantiTect Probe RT-PCR Kit を用いた1ステップRT-PCR(PCR効率:101%)。|IL1R2(interleukin 1 receptor, type II)に特異的なプライマーおよび FAM標識プローブを用いて、白血球から調製したRNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。QuantiTect Probe RT-PCR Kit を用いた1ステップRT-PCR(PCR効率:104%)。|バランスの取れたKCl および(NH4)2SO4 の組み合わせは、プライマーおよびプローブのPCRテンプレートへの特異的なアニーリングを促進する。K+ は二本鎖DNAのリン酸基に結合し、プライマーとプローブのアニーリングを安定化する。NH4+ は、ミスマッチな塩基対間の水素結合を不安定化する。|
パフォーマンス

QuantiTect Probe RT-PCR Kit は、PCRテンプレートへのプライマーとプローブの高度に特異的なアニーリングを促進するユニークなRT-PCRバッファーを備えています。このバッファーは、他のポリメラーゼと比べて非常に厳密なホットスタートを実現するHotStarTaq DNA Polymeraseを含んでいます(図 "特異性の高い増幅")。

QuantiTect Probe RT-PCR Kitに添付のHotStarTaq DNA PolymeraseとユニークなRT-PCRバッファー成分により、低コピー数のRNAターゲットを高感度で定量し、広範囲にわたり直線性のある正確な定量を実現します (図 "幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現")。リアルタイムの2ステップRT-PCRで得られたCT 値に匹敵するCT 値が示しているとおり、逆転写反応とPCRを同じ管内で連続的に起こしても、感度は低下しません(図 "2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - A" 、"2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - B"、および表)。

2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR
cDNA/RNA量平均 CT 平均 CT
(2ステップ RT-PCR)(1ステップRT-PCR)
100 ng24.6624.66
10 ng28.1527.84
1 ng31.4231.49
0.1 ng34.8034.56
0.01 ng37.7837.66
図"2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - A" および"2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - B"に示した2つの増幅プロットから得たCT
原理

QuantiTect Probe RT-PCR Kit には、配列特異的なプローブを用いてRNAターゲットのリアルタイム定量を高感度で正確に行なうために、至適化済みの即使用可能なマスターミックスが添付されています。本キットは、加水分解プローブ(TaqMan などのダブル標識プローブ)、FRETプローブ、Molecular Beaconsなどのあらゆる種類の配列特異的プローブを使用できるようにデザインされています。QuantiTect Probe RT-PCR Kit に添付のユニークなバッファーのK+/NH4+イオン配合比により、プライマーとプローブが核酸テンプレートに効率的かつ安定してアニーリングし、高いPCR効率を実現します(図 “特異的なアニーリング”)。さらに、HotStarTaq DNA Polymeraseが、厳密なホットスタートを実現して非特異的産物の形成を防ぐ一方で、逆転写酵素の最適な混合が、様々な量のRNA テンプレートからcDNAを合成することを可能にします。

QuantiTect Probe RT-PCR Master MixもdUTPが含まれているので、uracil-N-glycosylase(UNG)による前処理をPCR開始前に行なうことができます。従って、混入しているPCR産物がその後のPCR反応に影響を与えることはありません。

2x QuantiTect Probe RT-PCR Kitの成分
成分 特長 利点
HotStarTaq DNA Polymerase 95℃、15分の活性化 室温での定量PCRのセットアップ
QuantiTect Probe RT-PCR Buffer NH4+ イオンとK+ イオンの配合バランス 特異性の高いプライマーのアニーリングで信頼性の高いPCR結果
dNTP Mix 一部dTTPの代わりにdUTPを含むので、PCR産物にコンタミが予想される場合、オプションのUNG処理が可能 PCR産物のキャリーオーバーによるコンタミをオプションのUNG処理により除去
ROX 色素 Applied Biosystems およびAgilent製装置での蛍光シグナルを補正 ROXが必要なサイクラーで正確な定量。他のリアルタイムサイクラーでの反応を妨害しない
Omniscript Reverse TranscriptaseおよびSensiscript Reverse Transcriptase RNAに対する高い親和性を有する酵素の特別な混合 複雑な二次構造のRNAでも転写可能
操作手順

QuantiTect Probe RT-PCR Kit は面倒で時間のかかる反応条件の至適化が不要です。プライマー、プローブ、およびRNAテンプレートを即使用可能なRT-PCRマスターミックスに添加するだけで、反応を開始することができます(フローチャート “1ステップRT-PCR”)。リアルタイムサイクラーに関する迅速かつ正確な結果を得るために、ハンドブックに記載されているプロトコールに従ってください。PCR 開始前にuracil-N-glycosylase(UNG)で前処理することにより、PCR 増幅産物のコンタミは分解され、続いて行なうPCR に影響を与えません。

アプリケーション

QuantiTect Probe RT-PCR Kitsは、RNAターゲットの発現解析をほとんどのサーマルサイクラーで行なえます。これには、Applied Biosystems およびBio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilent 製サイクラーを含みます。Rotor-Gene Q および他のRotor-Gene サイクラーを使用する場合は、専用に開発されたRotor-Gene Probe RT-PCR Kitの使用をお勧めします。

Feature
Specifications
Applications Real-time quantification of RNA targets
Reaction type One-step RT-PCR
Real-time or endpoint Real-time
Sample/target type RNA targets
Single or multiplex Single
SYBR Green I or sequence-specific probes Sequence-specific probes
Thermal cycler All real-time cyclers (e.g. LC, RG, ABI)
With or without ROX With ROX

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FAQ
27
FAQ ID -1056
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FAQ ID -1066
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FAQ ID -729
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FAQ ID-751
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FAQ ID -784
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キットハンドブック
2
For quantitative, real-time one-step RT-PCR using sequence-specific probes
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配列特異的プローブを用いたリアルタイム定量1ステップRT-PCR
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クイックスタートプロトコール
1
MSDS
1
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画像
PCR and two-step RT-PCR.
1ステップRT-PCR

QuantiTect Probe RT-PCR Kit は面倒で時間のかかる反応条件の至適化が不要。プライマー、プローブ、RNA テンプレートを即使用可能なRT-PCRマスターミックスに添加するだけで、どのリアルタイムサイクラーでも反応を開始することができる(表"QuantiTect Probe RT-PCR Kit の成分"も参照)。

Highly specific amplification.
特異性の高い増幅
他社のDNAポリメラーゼと比較した結果、ユニークなバッファーと組み合わせたHotStarTaq DNA Polymeraseのみが497 bp フラグメントを特異的に増幅させた(1 µgのヒトゲノムDNAに添加した50 コピーのHIV-pol-遺伝子コンストラクトからのフラグメント)。M:マーカー。
Wide dynamic range in one-step RT-PCR
幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現

ヒト28S rRNAに特異的なプライマーおよび HEX標識プローブとQuantiTect Probe RT-PCR Kitを用いて、HeLa細胞RNAの10倍連続希釈液(100 ng~1 pg)をABI PRISM 7900 でduplicateで解析した。テンプレートを106倍希釈した溶液で高いPCR効率が得られた。

One-Step RT-PCR with Comparable Performance to Two-Step RT-PCR
2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - A

IL1R2(interleukin 1 receptor, type II)に特異的なプライマーおよび FAM標識プローブを用いて、白血球から調製したcDNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。QuantiTect Probe RT-PCR Kit を用いた1ステップRT-PCR(PCR効率:101%)。

One-step RT-PCR with comparable performance to a two-step RT-PCR
2ステップRT-PCRのパフォーマンスと同等の1ステップRT-PCR - B

IL1R2(interleukin 1 receptor, type II)に特異的なプライマーおよび FAM標識プローブを用いて、白血球から調製したRNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。QuantiTect Probe RT-PCR Kit を用いた1ステップRT-PCR(PCR効率:104%)。

Specific primer annealing using a balanced combination of K+ and NH4+ ions
特異的なプライマーアニーリング
バランスの取れたKCl および(NH4)2SO4 の組み合わせは、プライマーおよびプローブのPCRテンプレートへの特異的なアニーリングを促進する。K+ は二本鎖DNAのリン酸基に結合し、プライマーとプローブのアニーリングを安定化する。NH4+ は、ミスマッチな塩基対間の水素結合を不安定化する。