QuantiTect Probe PCR Kits

配列特異的なプローブを用いたリアルタイムPCRおよび2ステップRT-PCR用

  • 低コピーターゲットの高感度な検出
  • テンプレートの数段階の対数希釈範囲で正確な定量
  • 殆どのリアルタイムサイクラー上で、殆どの配列特異的なプローブに対応
  • UNG (uracil-N-glycosylase) 添付あるいは未添付のキットを選択可能
  • 反応およびサイクリング条件の至適化不要

QuantiTect Probe PCR Kitsは配列特異的なプローブを用いてリアルタイムPCRおよび2ステップリアルタイムRT-PCRで高感度にgDNAおよびcDNAターゲットを定量します。ホットスタートと即使用可能なマスターミックス中の独自のPCRバッファーシステムの組み合わせは、至適化なしにほとんどのサイクラーで高感度なqRT-PCRを実現します。dNTP MixはdUTP を含み、オプションのUNG処理ができます。マスターミックスは2~8 ℃で保存でき、簡便に取り扱えます。

製品名 Cat. no. List price:
QuantiTect Probe PCR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 2 x 2 ml RNase-Free Water
204343
¥59,000
QuantiTect Probe PCR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 20 ml RNase-Free Water
204345
¥234,000
QuantiTect Probe PCR +UNG Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 100 ul UNG Solution, 2 x 2 ml RNase-Free Water
204363
¥65,000

QuantiTect Probe PCR Kits は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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効果的なUNG 前処理|2ステップRT-PCR|特異性の高い増幅|幅広いダイナミックレンジをもつ2ステップPCR|幅広いダイナミックレンジをもつリアルタイムPCR|幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現|特異的なプライマーアニーリング|
dUMP を含むPCRアンプリコン(106 コピー)2 種類をUNG の存在下/非存在下で処理した後、リアルタイムPCRにより増幅した。様々なメーカーのUNGを使用し、QuantiTect Probe PCR +UNG Kit に添付のマスターミックスでリアルタイムPCR を行なった。Y 軸のΔCTは、UNG 処理を行なったサンプルの CT値からUNG 処理を行なっていないサンプルのCT値を差し引いた値である。QuantiTect Kit(QIAGEN)に添付のUNG では最大の ΔCT(9~12 サイクル)が得られた。このことは、他のメーカーのUNGよりもQIAGEN のUNGが最も効率的にキャリーオーバーしたPCR 産物を分解したことを示す。|QuantiTect Probe PCR Kit は面倒で時間のかかる反応条件の至適化が不要。プライマー、プローブ、DNAテンプレートを即使用可能なPCRマスターミックスに添加するだけで、ほとんどのリアルタイムサイクラーで反応を開始することができる(表 "2x QuantiTect Probe PCR Master Mixの成分")。|他社のDNAポリメラーゼと比較した結果、ユニークなバッファーと組み合わせたHotStarTaq DNA Polymeraseのみが497 bp フラグメントを特異的に増幅した(1 µgのヒトゲノムDNAに添加した50 コピーのHIV-pol-遺伝子コンストラクトからのフラグメント)。M:マーカー。|ヒト白血球cDNA の10 倍段階希釈液(0.01ng ~ 10 ng)とIL1R2(サイトカイン)用TaqMan アッセイを用いてMx3005P 上でduplicate で反応を行なった。QuantiTect Probe PCR Kit により、101%のPCR 効率で幅広いテンプレート量からの正確な遺伝子発現解析が行なえた。|QuantiTect Probe PCR +UNG Kitを用いて、UNG 前処理およびプローブによるリアルタイムPCRを行なった。ヒト白血球cDNAの10倍段階希釈液(10 pg ~ 10 ng)とIL8(サイトカイン)用TaqMan アッセイを用いてABI PRISM 7900 上で反応をduplicateで行なった。増幅プロットは各濃度の間隔が均等であり、PCR 効率は94 %であった。|IL8 (interleukin 8)に特異的なプライマーおよびFAM標識プローブおよびQuantiTect Probe PCR Kitを用いて、白血球cDNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。テンプレートを106倍に希釈した溶液で97%のPCR効率が得られ、わずか1 pgのIL8転写物を高感度に検出した。| バランスの取れたKCl および (NH4)2SO4 の組み合わせは、プライマーおよびプローブのPCRテンプレートへの特異的なアニーリングを促進する。K+は二本鎖DNAのリン酸基に結合し、プライマーとプローブのアニーリングを安定化する。NH4+は、ミスマッチな塩基対間の水素結合を不安定化する。 |
パフォーマンス

QuantiTect Probe PCR KitはQuantiTect Reverse Transcription Kitと組み合わせて、感度と信頼性の高い結果を実現します(図“幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現”)。QuantiTect Probe PCR Kitに添付のユニークなPCRバッファー成分はまた、低コピー数のDNAターゲットを高感度で定量し、広範囲にわたり直線性のある正確な定量を実現します (図 “幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現”および“広範なダイナミックレンジを持つ2 ステップ RT-PCR”)。HotStarTaq DNA Polymeraseは他のポリメラーゼと比べて非常に厳密なホットスタートを実現することによりPCR反応の特異性がさらに増加します(図“特異性の高い増幅”)。

PCR コンタミの主要な原因は、その実験以前に行なったPCR 反応で増幅されたPCR 産物のキャリーオーバーです。PCR 開始前にUNG で前処理することにより、PCR 増幅産物のコンタミは分解され、続いて行なうPCR に影響を与えません。QuantiTect Probe PCR +UNG Kit に添付の特別に至適化されたUNG 溶液と実証済みのPCR マスターミックスの組み合わせは、PCR 産物のキャリーオーバーを効果的に回避し、ターゲット配列の定量が確実に行なえます(図“効果的なUNG前処理”および“幅広いダイナミックレンジをもつリアルタイムPCR”)。

原理

QuantiTect Probe PCR Kit には、配列特異的なプローブを用いてゲノムDNAあるいはcDNAターゲットのリアルタイム定量を高感度で正確に行うために、至適化済みの即使用可能なマスターミックスが添付されています。本キットは、TaqMan あるいはその他のダブル標識プローブ、FRETプローブ、Molecular Beacons などのほとんどのタイプの配列特異的プローブを使用するためにデザインされています。QuantiTect Probe PCR Kit に添付のユニークなバッファーのK+/NH4+イオン配合比により、プライマーとプローブが核酸テンプレートに効率的かつ安定してアニーリングし、高いPCR効率を実現します(図 “特異的なプライマーアニーリング”)。さらに、バッファーには他のポリメラーゼと比べて非常に厳密なホットスタートを実現するHotStarTaq DNA Polymeraseが入っています。

QuantiTect Probe PCR Master MixはまたdUTPを含み、PCR 開始前にUNG(uracil-N-glycosylase)で前処理することにより、PCR 増幅産物のコンタミは分解され、続いて行なうPCR に影響を与えません。

2x QuantiTect Probe PCR Master Mix の成分
成分 特長 利点
HotStarTaq DNA Polymerase 95℃、15分の活性化 室温での定量PCRのセットアップ
QuantiTect Probe PCR Buffer NH4+とK+イオンの配合バランス 特異性の高いプライマーのアニーリングで信頼性の高いPCR結果
dNTPミックス 一部dTTPの代わりにdUTPを含むので、PCR産物にコンタミが予想される場合、オプションのUNG処理が可能 PCR産物のキャリーオーバーによるコンタミをオプションのUNG処理で除去
ROX 色素 Applied Biosystems およびAgilent製装置での蛍光シグナルを補正 ROX色素が必要なサイクラーで正確な定量。他のリアルタイムサイクラーでの反応を妨害しない
操作手順

QuantiTect Probe PCR Kit を用いると、手間と時間のかかる反応条件の至適化を行なう必要がありません。プライマー、プローブ、DNAテンプレートを即使用可能なPCRマスターミックスに添加するだけで、反応を開始することができます(フローチャート “2ステップRT-PCR”)。ハンドブックに記載されているプロトコールに従うだけで、ほとんどのリアルタイムサイクラーで迅速かつ正確な結果が得られます。必要に応じて、前の反応液からのPCR 産物の混入を防ぐために、反応液をuracil-N-glycosylase(UNG)で前処理することができます。

2ステップリアルタイムRT-PCRで良好な結果を得るためには、QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いてcDNAを合成することをお薦めします。ゲノムDNAの除去を組み合わせて、わずか20分で迅速なcDNA合成を実現します。

アプリケーション

QuantiTect Probe PCR Kitsはプローブを利用したcDNAターゲットの遺伝子発現解析あるいはgDNAの定量解析をほとんどのサーマルサイクラーで行なえます。これには、Applied Biosystems およびBio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilent 製サイクラーを含みます。Rotor-Gene Q および他のRotor-Gene サイクラーを使用する場合は、これらの高速サイクリング用に開発されたRotor-Gene Probe PCR Kitの使用をお勧めします。

Feature
Specifications
Applications Real-time quantification of DNA, cDNA, or RNA targets
Reaction type PCR and two-step RT-PCR
Real-time or endpoint Real-time
Sample/target type DNA, cDNA, RNA
Single or multiplex Single
SYBR Green I or sequence-specific probes Sequence-specific probes
Thermal cycler Most real-time cyclers (e.g. LC, RG, ABI)
With or without ROX With ROX

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FAQ
30
FAQ ID -1056
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FAQ ID -1085
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FAQ ID -1086
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FAQ ID -1438
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-20
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FAQ ID -540
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FAQ ID -543
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FAQ ID -564
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FAQ ID -584
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FAQ ID -587
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FAQ ID -589
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FAQ ID -729
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FAQ ID-751
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FAQ ID -784
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キットハンドブック
3
For use with QuantiTect PCR Kits to eliminate carryover of PCR products
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For quantitative, real-time PCR and two-step RT-PCR using sequence-specific probes
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配列特異的プローブを用いたリアルタイム定量PCRおよび2ステップRT-PCR用
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サイエンティフィック・ポスター
1
クイックスタートプロトコール
1
MSDS
1
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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画像
Effective UNG digestion.
効果的なUNG 前処理
dUMP を含むPCRアンプリコン(106 コピー)2 種類をUNG の存在下/非存在下で処理した後、リアルタイムPCRにより増幅した。様々なメーカーのUNGを使用し、QuantiTect Probe PCR +UNG Kit に添付のマスターミックスでリアルタイムPCR を行なった。Y 軸のΔCTは、UNG 処理を行なったサンプルの CT値からUNG 処理を行なっていないサンプルのCT値を差し引いた値である。QuantiTect Kit(QIAGEN)に添付のUNG では最大の ΔCT(9~12 サイクル)が得られた。このことは、他のメーカーのUNGよりもQIAGEN のUNGが最も効率的にキャリーオーバーしたPCR 産物を分解したことを示す。
PCR and two-step RT-PCR.
2ステップRT-PCR

QuantiTect Probe PCR Kit は面倒で時間のかかる反応条件の至適化が不要。プライマー、プローブ、DNAテンプレートを即使用可能なPCRマスターミックスに添加するだけで、ほとんどのリアルタイムサイクラーで反応を開始することができる(表 "2x QuantiTect Probe PCR Master Mixの成分")。

Highly specific amplification.
特異性の高い増幅
他社のDNAポリメラーゼと比較した結果、ユニークなバッファーと組み合わせたHotStarTaq DNA Polymeraseのみが497 bp フラグメントを特異的に増幅した(1 µgのヒトゲノムDNAに添加した50 コピーのHIV-pol-遺伝子コンストラクトからのフラグメント)。M:マーカー。
Wide dynamic range in two-step RT-PCR
幅広いダイナミックレンジをもつ2ステップPCR

ヒト白血球cDNA の10 倍段階希釈液(0.01ng ~ 10 ng)とIL1R2(サイトカイン)用TaqMan アッセイを用いてMx3005P 上でduplicate で反応を行なった。QuantiTect Probe PCR Kit により、101%のPCR 効率で幅広いテンプレート量からの正確な遺伝子発現解析が行なえた。

Wide dynamic range in real-time PCR.
幅広いダイナミックレンジをもつリアルタイムPCR
QuantiTect Probe PCR +UNG Kitを用いて、UNG 前処理およびプローブによるリアルタイムPCRを行なった。ヒト白血球cDNAの10倍段階希釈液(10 pg ~ 10 ng)とIL8(サイトカイン)用TaqMan アッセイを用いてABI PRISM 7900 上で反応をduplicateで行なった。増幅プロットは各濃度の間隔が均等であり、PCR 効率は94 %であった。
High sensitivity and efficiency, and wide dynamic range.
幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現
IL8 (interleukin 8)に特異的なプライマーおよびFAM標識プローブおよびQuantiTect Probe PCR Kitを用いて、白血球cDNA(100 ng~1 pg)の10倍連続希釈液をMx3005でduplicateで解析した。テンプレートを106倍に希釈した溶液で97%のPCR効率が得られ、わずか1 pgのIL8転写物を高感度に検出した。
Specific primer annealing using a balanced combination of K+ and NH4+ ions
特異的なプライマーアニーリング

バランスの取れたKCl および (NH4)2SO4 の組み合わせは、プライマーおよびプローブのPCRテンプレートへの特異的なアニーリングを促進する。K+は二本鎖DNAのリン酸基に結合し、プライマーとプローブのアニーリングを安定化する。NH4+は、ミスマッチな塩基対間の水素結合を不安定化する。