EpiTect Whole Bisulfitome Kit

Bisulfite変換したDNAをPCR解析用に全ゲノム増幅
  • 複数のPCR反応が可能な高収量のBisulfite変換DNA
  • Bisulfite変換DNAの均一かつ正確な増幅
  • 簡便な1ステップ反応セットアップ

EpiTect Whole Bisulfitome Kit にはDNA ポリメラーゼ、バッファー、試薬が含まれ、Multiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーを利用して全Bisulfite 変換ゲノム(Bisulfitome)の増幅を実現します。EpiTect Whole Bisulfitome Kit は、EpiTect Bisulfite Kitsによる変換後のDNAの増幅専用に開発されました。EpiTect Whole Bisulfitome Kitは実証済みのREPLI-gテクノロジーを用いており、Bisulfite変換DNAの特殊なニーズ(Bisulfite変換によりDNA断片長が短くなり、ヌクレオチド組成が変化している)に対応し、変換された配列自体を維持したまま増幅します。EpiTect Whole Bisulfitome Kit によるDNA収量は反応あたり1 ~ 3 µgであり、わずか1 回のBisulfite反応で最高300 回のPCR解析が可能な十分な量が得られます。

製品名 Cat. no. List price:
EpiTect Whole Bisulfitome Kit (25)
REPLI-g Midi DNA Polymerase, EpiTect WBA Reaction Buffer, nuclease-free water for 25 whole bisulfitome amplification reactions
59203
¥55,000

EpiTect Whole Bisulfitome Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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信頼できる全Bisulfitome増幅|高い増幅効率|WBA 操作手順|Bisulfite変換および全Bisulfitome増幅 (WBA) DNAのEpiTYPER® MALDI-TOF 解析|エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー|

EpiTect Whole Bisulfitome Amplification Kitを用いた全Bisulfitome増幅の前後(-WBAと+WBA)で4種類の遺伝子座の状態をQuantiTect SYBR® Green PCR KitによるリアルタイムPCRで調べた。まず、DNAをEpiTect Bisulfite Kit またはZ社のキットを用いてBisulfite変換した後、増幅した。QuantiTect SYBR® Green PCR Kitを用いて定量PCRを行なった。EpiTectにより変換したDNAでは、4種類の遺伝子座の状態は、増幅前と増幅後で同様であった。他社のBisulfiteキットのほうが変換したDNAのCT 値が高く、他社キットではWBA前にDNAが断片化していることが示された。他社キットでは、増幅後の4種類の遺伝子座の状態は増幅前と異なっており、Bisulfite変換DNAの増幅率は低く、均一でないことが示された。|スタートサンプルとして50 ngのBisulfite変換DNAを全Bisulfitome増幅反応に使用した。EpiTect Whole Bisulfitome KitならびにA社およびS社のキットを用いて増幅した。増幅反応後のDNA収量をPicoGreenを用いて測定した。EpiTect Whole Bisulfitome Kitでは、他社キットの収量よりもはるかに高い50倍のDNA収量か得られた。|ユニークなDNA Polymeraseを含むマスターミックスをBisulfite変換DNA(50 ng以上)に添加する。等温での増幅反応後、DNAポリメラーゼは熱不活化され、増幅された変換DNAは解析に即使用可能であり、保存もできる。増幅前のBisulfite変換およびDNAクリーンアップにはEpiTect Plus Bisulfite Kitsを使用することを推奨。このキットのDNA Protect テクノロジーは、DNAの断片化を防ぐ。DNAの断片化防止は、MDA(multiple displacement amplification)法を用いた増幅を成功させる上で不可欠である。|メチル化DNAサンプル (UMDNA 1),非メチル化DNAサンプル(VIAL A 1)、および両者の混和物 (HTXA 1)をMP6遺伝子座のメチル化状態を調べるために用いた。 この結果を、EpiTect Whole Bisulfitome Kitを用いて全Bisulfitome増幅(WBAUMDNA1, WBAHTXA 1, WBAVIAL A 1)後に得られた結果と比較した。増幅前のメチル化パターンと増幅したDNAのメチル化パターンは非常によく似ており、増幅前の状態を保っていることを示しています。(データ提供:Hany EzzeldinMayo Clinic, Rochester, USA)||

パフォーマンス
従って、Bisulfite変換DNAが限られた量しかない場合でも、EpiTect Whole Bisulfitome Kitを使用すると必要なメチル化解析に十分なDNAを得ることができます。EpiTect Bisulfite Kitsと組み合わせて使用すれば、このWBA(whole bisulfitome amplification)操作により、遺伝子座の状態を正確に保ったままBisulfite変換DNAの収量を増やすことが可能です。EpiTect Whole Bisulfitome Kit は、他社の増幅キットよりも優れた結果を示しました(図 "高い増幅効率" および "信頼できる全Bisulfitome増幅")。
原理

サンプルが少量であるために、ゲノムDNA配列のメチル化解析が制限されることがあります。EpiTect Whole Bisulfitome Kit は、全Bisulfite変換ゲノム全体を配列のバイアスなく非常に均一に増幅します(図 "Bisulfite変換および全Bisulfitome増幅 (WBA) DNAのEpiTYPER® MALDI-TOF 解析")。この方法は、等温のMDA (Multiple Displacement Amplification) テクノロジーをベースにしています。 3'→5' エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を持つユニークなDNA Polymeraseは、複製プロセスの間、非常に高い正確性を維持します。 

EpiTect Whole Bisulfitome Kitは 実証済みのREPLI-gテクノロジーを用いて特別に開発され、Bisulfite変換DNAの特殊なニーズ(Bisulfite変換によりDNAフラグメントサイズがより小さく、ヌクレオチド組成が変化している)に対応し、変換された配列自体を維持したまま増幅します。ユニークな成分で構成されたDNA保護システムを含むEpiTect Plus Bisulfite Kitsとの組み合わせにより最高の結果が得られます。EpiTect Plus Bisulfite Kitsは、完全なシトシン変換に必要なDNA変性を効果的に行ない、Bisulfite変換反応時の高温かつ低pH条件により起こる過剰なDNA断片化を防ぎます。DNAの断片化を防ぐことにより、長いDNAフラグメントの増幅が可能です。EpiTect Whole Bisulfitome Kitは、一般的に1反応あたり収量1~3 μg のDNAを生成します。

操作手順

反応セットアップは便利な一段階で、Bisulfite 変換テンプレートDNAを反応バッファーおよび REPLI-g DNA ポリメラーゼの混合液とインキュベートするだけです。ポリメラーゼを熱により不活化した後、増幅したDNAをすぐに解析に使用するか、または保存することができます(図 "WBA 操作手順")。

エピジェネティクス情報を得ることは生物学や医学研究における多くの分野(特に、腫瘍学や幹細胞研究、および発生生物学)にとって最も重要です。しかし、DNA メチル化における変化の解析は、サンプル(特に非常に限られた量のサンプル)から再現性のあるデータを得るための標準化された方法がないために非常に困難です。QIAGENが新しく紹介するEpiTect製品により、DNAサンプル採取、安定化、精製からBisulfite処理、リアルタイムPCRやエンドポイントPCR、メチル化解析、シークエンシングまで、標準化されたプレアナリティカル用製品および解析用製品を提供致します。(図 "エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー")。

アプリケーション

従って、Bisulfite変換DNAが限られた量しかない場合でも、EpiTect Whole Bisulfitome Kitを使用すると必要なメチル化解析に十分なDNAを得ることができます。EpiTect Whole Bisulfitome Kitにより増幅したDNAは、1反応あたり10 ngの増幅DNA を使用するとして、100~ 300 回分のリアルタイムPCRアッセイ(例; EpiTect MethyLight PCR Kit 使用)、エンドポイントPCR(例; EpiTect MSP Kit 使用)などに使用できます。

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キットハンドブック
3
MSDS
1
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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安全データシート
1
画像
Reliable whole bisulfitome amplification
信頼できる全Bisulfitome増幅

EpiTect Whole Bisulfitome Amplification Kitを用いた全Bisulfitome増幅の前後(-WBAと+WBA)で4種類の遺伝子座の状態をQuantiTect SYBR® Green PCR KitによるリアルタイムPCRで調べた。まず、DNAをEpiTect Bisulfite Kit またはZ社のキットを用いてBisulfite変換した後、増幅した。QuantiTect SYBR® Green PCR Kitを用いて定量PCRを行なった。EpiTectにより変換したDNAでは、4種類の遺伝子座の状態は、増幅前と増幅後で同様であった。他社のBisulfiteキットのほうが変換したDNAのCT 値が高く、他社キットではWBA前にDNAが断片化していることが示された。他社キットでは、増幅後の4種類の遺伝子座の状態は増幅前と異なっており、Bisulfite変換DNAの増幅率は低く、均一でないことが示された。

High Amplification Efficiency in Comparison to Other Suppliers
高い増幅効率

スタートサンプルとして50 ngのBisulfite変換DNAを全Bisulfitome増幅反応に使用した。EpiTect Whole Bisulfitome KitならびにA社およびS社のキットを用いて増幅した。増幅反応後のDNA収量をPicoGreenを用いて測定した。EpiTect Whole Bisulfitome Kitでは、他社キットの収量よりもはるかに高い50倍のDNA収量か得られた。

Amplification procedure
WBA 操作手順
ユニークなDNA Polymeraseを含むマスターミックスをBisulfite変換DNA(50 ng以上)に添加する。等温での増幅反応後、DNAポリメラーゼは熱不活化され、増幅された変換DNAは解析に即使用可能であり、保存もできる。増幅前のBisulfite変換およびDNAクリーンアップにはEpiTect Plus Bisulfite Kitsを使用することを推奨。このキットのDNA Protect テクノロジーは、DNAの断片化を防ぐ。DNAの断片化防止は、MDA(multiple displacement amplification)法を用いた増幅を成功させる上で不可欠である。
EpiTYPER® MALDI-TOF Analysis of Bisulfite Converted and Whole Bisulfitome Amplified (WBA)
Bisulfite変換および全Bisulfitome増幅 (WBA) DNAのEpiTYPER® MALDI-TOF 解析

メチル化DNAサンプル (UMDNA 1),非メチル化DNAサンプル(VIAL A 1)、および両者の混和物 (HTXA 1)をMP6遺伝子座のメチル化状態を調べるために用いた。 この結果を、EpiTect Whole Bisulfitome Kitを用いて全Bisulfitome増幅(WBAUMDNA1, WBAHTXA 1, WBAVIAL A 1)後に得られた結果と比較した。増幅前のメチル化パターンと増幅したDNAのメチル化パターンは非常によく似ており、増幅前の状態を保っていることを示しています。(データ提供:Hany EzzeldinMayo Clinic, Rochester, USA)

Standardized Workflows in Epigenetics
エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー