RNAi実験を簡単に確立
  • RNAi実験の至適化と確立のための完璧なコントロールセット
  • 低濃度siRNAを用いて高いトランスフェクション効果
  • 細胞死の観察によりトランスフェクションの至適化を簡便化
  • ノックダウン検証用にフレキシブルなツール

RNAi Human/Mouse Starter Kitを用いてsiRNAによるRNAiの簡単な確立、トランスフェクション条件の至適化、ルーチンなコントロール実験ができます。本キットには、徹底的にテストし検証済みのネガティブコントロールsiRNAであるAllStars Negative Control siRNA、MAPK1 positive control siRNA、AllStars Hs Cell Death Control siRNAおよびHiPerFect Transfection Reagentが入っています。

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RNAi Human/Mouse Starter Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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効果的なMAPK1ノックダウンを定量RT-PCRで実証。|いくつかの細胞株におけるMAPK1タンパク質の発現|効果的なMAPK1ノックダウンをウェスタンブロット解析で実証|
[A] HeLa細胞、[B] MCF-7細胞、[C] NIH/3T3細胞に様々な濃度のポジティブコントロールMAPK1 siRNAとnonsilencing siRNAをトランスフェクトした。48時間後に、細胞を溶解し、RNeasy Mini Kitを用いてトータルRNAを精製した。QuantiTect Kitsを用いてリアルタイム定量RT-PCRを行なった。MAPK1の発現はGAPDH発現に対して標準化し、トランスフェクトしていない細胞のRNAを用いて調整した標準曲線を用いて定量した。|ウェスタンブロット解析は、様々なヒトおよびマウス細胞株においてMAPK1の発現を示している。Tubulinは抗tubulin一次抗体を用いて検出し、内部負荷コントロールとして使用した。|ヒトおよびマウスMAPK1 mRNAに一般的な配列を標的としたポジティブコントロールsiRNAまたはnonsilencing siRNA(Control siRNA)をHiPerFect Transfection Reagentを用いてMCF-7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションとインキュベーションの後、タンパク質発現をウェスタンブロット解析により調べた。トランスフェクトしていない細胞も解析した。|
パフォーマンス
RNAi Human/Mouse Starter Kitは非常に効率的でテスト済みの試薬であり、siRNAはコントロール実験の成功を保証します(図"効果的なMAPK1ノックダウンをウェスタンブロット解析で実証"および"効果的なMAPK1ノックダウンを定量RT-PCRで実証")。
原理

RNAi実験を始める時、あるいは新規細胞系でのRNAi実験を確立する際には、コントロール実験および条件の至適化が必要です。さらに、RNAi実験の結果を完璧かつ厳密に解析するためには、適切なコントロール実験のデータが重要です。サイレンシング効果がなく、哺乳動物遺伝子と相同性のない蛍光標識ネガティブコントロールsiRNA は、トランスフェクション条件の至適化および非特異的なサイレンシング効果のコントロールとして有用です。ポジティブコントロールのsiRNAは遺伝子を高いレベルでノックダウンすることが知られています。ルーチンでこのsiRNAを目的のsiRNAと平行してトランスフェクトすることにより、最適な条件の維持および実験結果の確認を行なうことができます。RNAi Human/Mouse Starter Kit にはヒトおよびマウスの両方の細胞株でコントロール実験や最初の実験が簡単に行なえるようにポジティブコントロールsiRNA およびネガティブコントロールsiRNA が入っています。さらに、ヒト細胞の細胞死表現型のコントロールが入っています。これにより、トランスフェクション条件の確立とモニタリングが容易になります。

高度に検証されたsiRNAは、ネガティブコントロールおよびトランスフェクションのモニターとして使用できます。

RNAi Human/Mouse Starter Kitには、AllStars Negative Control siRNAが入っています。AllStars Negative Control siRNAは現在入手できるsiRNAで最も徹底的にテストされた検証済みネガティブコントロールsiRNAです。このsiRNAは既知の哺乳類の遺伝子とは相同性がありません。このコントロールsiRNA はAffymetrix GeneChip アレイや細胞ベースアッセイを用いて検証され、遺伝子発現や表現型への非特異的な影響は最小限であることを示しました 。クローニング実験によりAllStars Negative Control siRNAはRISCに取り込まれることが確認されました。

最適なポジティブコントロールであるMAPK1 siRNA

本キットにはヒトおよびマウス両方のMAPK1 mRNAに共通の配列を標的にした検証済みsiRNAが入っています。プロテインキナーゼMAPK1(Erk2あるいはMAPK2とも呼ばれる)は、様々なヒトおよびマウス細胞株に発現しています。ヒトおよびマウス細胞ライセートのウェスタンブロット解析を行なった結果は、MAPK1は普遍的に発現していることを示しています(図"いくつかの細胞株におけるMAPK1タンパク質の発現")。このキットに入っているポジティブコントロールのsiRNAは純度が高く、ヒトおよびマウスMAPK1遺伝子配列両方と100%の相同性を示します。このMAPK1ポジティブコントロールsiRNAは、ヒトおよびマウス細胞株のMAPK1発現をほぼ抑制します(図"効果的なMAPK1ノックダウンをウェスタンブロット解析で実証"および"効果的なMAPK1ノックダウンを定量RT-PCRで実証")。実験条件が一定であることを確認するために、このポジティブsiRNAをルーチンでトランスフェクトすることができます。

操作手順
細胞死の観察によりトランスフェクションのモニタリングが容易

AllStars Hs Cell Death Control siRNAは、細胞生存に必要不可欠な遺伝子で、普遍的に発現しているヒト遺伝子を標的とした非常に効果的なsiRNAのミックスです。これらの遺伝子がノックダウンされると、多量の細胞死が誘導され、光学顕微鏡で観察できます。AllStars Hs Cell Death Control siRNAは、siRNAトランスフェクションの至適化に有用なツールで、ヒト細胞でポジティブコントロールとして常に使用できます。

遺伝子サイレンシング効果の簡便な測定

mRNAレベルにおけるノックダウン効果は定量RT-PCRにより測定できます(図"効果的なMAPK1ノックダウンを定量RT-PCRで実証")。QIAGENはSYBR® Greenを用いたリアルタイムRT-PCRでの高感度で正確な定量に、検証済みで即使用可能なプライマーセットであるQuantiTect Primer Assayを販売しています。ヒト、マウス、ラット全遺伝子に対応するQuantiTect Primer AssaysとsiRNAはGeneGlobeで簡単にオンラインオーダーができます。

低濃度のsiRNAを用いて高いトランスフェクション効果

RNAi Human/Mouse Starter Kitには、低濃度のsiRNAで真核細胞に効率の高いsiRNAトランスフェクションとノックダウンを実現にするために開発されたHiPerFect Transfectionが入っています。RNAi実験において間違った判断に繋がる可能性があるオフターゲット効果は、低濃度のsiRNAを使用することにより大幅に回避できると研究者達は示唆しています。

アプリケーション
実験開始時または新しい細胞株でのRNAiの確立
トランスフェクション条件の至適化
ルーチンでのコントロール実験
Feature
Specifications
Applications Routine control experiments, transfection optimization...
Cell type Human and mouse cells
Controls Positive control for mouse and human MAPK1, nonsilencing control siRNA
Features High transfection efficiency with low siRNA concentrations
Nucleic acid siRNA
Number of possible transfections >160 transfections per kit
Transfection type Transient transfection