RNAi実験でのネガティブコントロール

  • 徹底的に検証済みのネガティブコントロール
  • 既知の哺乳動物遺伝子との相同性は皆無
  • 非特異的な効果は最小限
  • miRNA mimic実験に使用可能
AllStars Negative Control siRNA は現在入手できるsiRNA で最も徹底的にテストされた実証済ネガティブコントロールsiRNAです。このsiRNA は既知の哺乳類の遺伝子とは相同性がありません。遺伝子発現や表現型への非特異的な影響を最小限にするため、Affymetrix GeneChipアレイおよび様々な細胞ベースのアッセイを用いて検証実験が実施されました。非特異的な影響を最小限に抑えることで、遺伝子特異的なsiRNAとネガティブコントロールによる結果の比較により、遺伝子発現や表現型への標的遺伝子による正確なノックダウン効果が確実に得られます。ネガティブコントロールが非特異的な効果を引き起こした場合には、RNAi実験の結果を間違って解釈したり、あるいは解釈が困難になります。クローニング実験によりAllStars Negative Control siRNAがRISCに組み込まれることが実証されました。AllStars Negative Control siRNAは特許出願中で配列情報は公開していません。
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Thoroughly tested and validated nonsilencing siRNA with no homology to any known mammalian gene,
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AllStars Negative Control siRNA  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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発現への非特異的な影響が低い。|細胞数は影響を受けなかった。|AllStars Negative Control siRNAのRISCへの取り込み|AllStars Negative Control siRNAのRISCへの取り込みを示すウエスタンブロット解析|通常のDNA合成における表現型。|細胞毒性効果の増加なし。|通常の細胞周期分布。|RISC取り込み実験のためのレポーターコンストラクト|核サイズの表現型は影響を受けない。|
複数のネガティブコントロールsiRNA(Control1~Control10)をMCF-7細胞にtriplicateでトランスフェクトした。インキュベーション後、cRNAを作製し、Affymetrix human U133 GeneChipアレイにハイブリダイズした。トランスフェクトしていない細胞と比較して、発現レベルで少なくとも1.5倍の変化を示した遺伝子を、影響された遺伝子(抑制および誘導の両方)と同定した。それぞれのパスウェイでの代表的な遺伝子のうち、影響された遺伝子の割合を決定するためにIngenuity Pathway Analysis Softwareを使用した。棒グラフの長さはsiRNAにより影響を受けたパスウェイにおける遺伝子の割合を示す。各パスウェイの遺伝子が影響を受た場合を相対的割合としては100%を示す。棒グラフの長さが短い場合には、そのパスウェイで影響を受けた遺伝子の相対的割合が低いことを示す。棒グラフが存在しない部分は、パスウェイ内のどの遺伝子もそのsiRNAに影響されなかったことを示す。AllStars Negative Control siRNA(矢印で示す)では影響を受けた遺伝子の数が最も少ないという結果が得られた。一方、他のコントロールsiRNAでは、重要な細胞内パスウェイに関与する遺伝子で影響を受けたものが多かった。|AllStars Negative Control siRNA、その他のネガティブコントロールsiRNA(Control 1)を同数のMCF-7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしていない細胞も解析された。72時間後に細胞を回収、PBSで洗浄後TruCOUNTチューブに移し、FACS解析により測定した。|

MCF-7およびHeLa細胞にレポーターコンストラクトと、非相補的なsiRNAまたはAllStars Negative Control siRNAのいずれかとコトランスフェクションした。24時間後、蛍光レポーター遺伝子の発現を [A]蛍光顕微鏡(HeLa細胞が示されている)と [B]、[C]をFACS分析により測定した。非相補的なsiRNAとコトランスフェクションしたあとは正常な蛍光強度が観察され、レポーター遺伝子が発現していることを示している。AllStars Negative Control siRNAとコトランスフェクションした後、蛍光強度は有意に減少し、レポーター遺伝子がダウンレギュレートされていることを示している。

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HeLa細胞にレポーターコンストラクトと、非相補的なsiRNAまたはAllStars Negative Control siRNAのいずれかとコトランスフェクションした。48時間後、ウェスタンブロット分析によりHisタグの発現を測定した。Hisタグは、非相補的なsiRNAを用いたコトランスフェクションの後に発現した。 AllStars Negative Control siRNAとコトランスフェクション後、Hisタグは検出されなかった。

|HCT-116細胞(6 x 104) に [A] トランスフェクションなし、[B] AllStars Negative Control siRNAまたは[C] 他のネガティブコントロールsiRNA(Control 1)をトランスフェクトした。72時間後に細胞をBrdUで処理し、固定、透過処理した。その後、細胞を抗BrdU–FITC抗体で染色した。DNA合成速度は、FACS解析を用いてBrdUポジティブ細胞 (M2領域) のパーセンテージを決定し測定した。BrdUポジティブ細胞のパーセンテージは、トランスフェクトしていない細胞およびAllStars Negative Control siRNAでトランスフェクトした細胞と同様であった(それぞれ53.1% と52.5% )。これとは対照的に、Control 1をトランスフェクトした細胞はわずか10%がBrdU陽性であり、DNA合成が変わったことを示した。|表記した数のMCF-7細胞に [A] トランスフェクションなし、[B] AllStars Negative Control siRNAをトランスフェクト、あるいは[C] 他のネガティブコントロールsiRNA(Control 1)をトランスフェクトした。72時間後、培養フラスコからすべての細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、FACSで数え、生細胞(ヨウ化プロピジウム陰性)と死細胞(ヨウ化プロピジウム陽性)の数を数えた。AllStars Negative Control siRNAのトランスフェクションは、トランスフェクトしていない細胞で観察された死細胞と同様の数値が得られた。(それぞれ10.8%と10.1%の死細胞)。他のコントロールsiRNAは細胞死のレベルが28.7%に増加した。|MCF-7細胞に、[A] 非トランスフェクトまたは[B] AllStars Negative Control siRNAまたは[C] CDC2 siRNAAをトランスフェクトした。CDC2のノックダウンは細胞周期に影響を与えG2期で細胞の蓄積が起きることが知られているので、CDC2 siRNAをポジティブコントロールとしてトランスフェクトした。72時間後、トリプシンを用いて細胞を培養皿から剥離し70%エタノールで固定した後、RNaseおよびヨウ化プロピジウム染色で処理した。 FACS分析は、各サンプルの40,000細胞で行った。 AllStars Negative Control siRNAをトランスフェクトした細胞の細胞周期分布は、非トランスフェクト細胞で観察されたものと同様であった。CDC2 siRNAをトランスフェクトした細胞の細胞周期分布は、予想されたように、G2期に細胞の蓄積を示した。|

レポーターコンストラクトは、Hisタグを有する蛍光レポーター遺伝子に融合したAllStars Negative Control siRNAに相補的なターゲット配列で構成されている。

|HCT 116細胞はAllStars Negative Control siRNA、別のネガティブコントロールsiRNA(Control 1)、およびCDC2 siRNAでトランスフェクトした。CDC2のノックダウンは細胞周期に影響を与え細胞サイズが増加することが知られているので、CDC2 siRNAをポジティブコントロールとしてトランスフェクトした。トランスフェクトしていない細胞も解析した。72時間後、生細胞の核をHoechst 33342で染色し、個々の細胞核の表面積をcell^R Imaging System (Olympus)で測定した。 このグラフでは、1処理あたり100の核サイズ測定値を大きさの順にプロットした。AllStars Negative Control siRNA はトランスフェクトしていない細胞と同様の核サイズのプロファイルが得られた。予想通りCDC2 siRNAでは核サイズが拡大した。ネガティブコントロールsiRNA、Control 1でも核サイズが拡大した。|
パフォーマンス

AllStars Negative Control siRNAの性能は表に記載の実験により検証しました。

実施したテスト
テストの種類テストの対象目的AllStars Negative Control siRNA での結果
ゲノムワイド解析Affymetrix GeneChip アレイ 遺伝子発現の非特異的な制御 制御された遺伝子数は非常に少ない
細胞ベースのアッセイ生存細胞の核染色 核の大きさ 正常
細胞ベースのアッセイ細胞数 増殖率 変化なし
細胞ベースのアッセイヌクレオチドの取り込みDNA 合成率 変化なし
細胞ベースのアッセイ生存細胞の色素排除 細胞毒性の効果 変化なし
細胞ベースのアッセイDNA 染色 細胞周期の配分 正常
RISC への取り込み解析 (HeLa および MCF-7 細胞) レポーターコンストラクトのトランスフェクション siRNA が RISC に取り込まれるかどうかを調査 (有効なコントロールsiRNA はRISC に入り込む)RISC に取り込まれた
Affymetrix GeneChip アレイ

複数のネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後、遺伝子発現への非特異的な影響のレベルをテストするためにゲノムワイドな解析を行ないました。HiPerFect Transfection Reagentを用いて異なる由来の複数のネガティブコントロールsiRNAをMCF-7、K562、初代HUVEC細胞にトランスフェクトしました。これらは、Nonsilencing siRNA(哺乳動物遺伝子と相同性がない)、スクランブルsiRNA(遺伝子特異的なsiRNAと同じ塩基組成を持つが配列が異なる)、人工的なレポーター遺伝子を標的にしたsiRNAが含まれています。続いて、Affymetrix GeneChipアレイを用いてヒト全ゲノムの発現プロファイリングを行ないました。AllStars Negative Control siRNAは非特異的に制御される遺伝子数が常に最も少ないことから、ネガティブコントロールに最適です。一方、他のネガティブコントロールsiRNAは重要な細胞内パスウェイに関与する多くの遺伝子を非特異的に抑制しました(図“発現への非特異的な影響が低い”)。

生存細胞の核染色

生存細胞の核染色を用いて核サイズを測定しました。サイズ変化は細胞周期障害や増殖阻害を示唆している可能性があります。様々なタイプのネガティブコントロールsiRNAを用いてテストを行ないました。AllStars Negative Control siRNAは、テストしたコントロールsiRNAの中で最高の結果を提供しました。AllStars Negative Control siRNAのトランスフェクションは、トランスフェクトしていない細胞と比較して、核の大きさに変更はありませんでした。一方、他のnegative control siRNA(Control 1)では核が拡大しました(図“核サイズの表現型は影響を受けない”)。

細胞数

細胞数は、細胞が正常に増殖していたかどうかを判断するために様々なネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後に評価しました。未処理の細胞とAllStars Negative Control siRNAをトランスフェクトした細胞では細胞数の違いはほとんど観察されませんでした。一方、その他のテストしたネガティブコントロールsiRNAのトランスフェクション後では細胞数は顕著に減少しており、Control 1のようにこれらのsiRNAが細胞増殖を抑制することを示唆しています(図“細胞数に影響を与えないsiRNA”)。

ヌクレオチドの取り込み

トランスフェクトしていないHCT-116細胞と様々なネガティブコントロールsiRNAでトランスフェクトしたHCT-116細胞におけるDNA合成速度を決定するために、ヌクレオチドの取り込みを測定しました。ヌクレオチド取り込みはブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込みを調べることにより測定しました。これはチミジンの塩基アナログで、DNA複製時のチミジンの代替として、新たに合成されたDNAに組み込まれます。 DNA合成率の変化は、細胞増殖または細胞周期の変化を示しています。 AllStars Negative Control siRNAをトランスフェクトした細胞のBrdU取り込み率は、トランスフェクトしていない細胞のそれに非常に類似していました。 しかし、テストした他のネガティブコントロールsiRNA(Control 1)では、DNA合成レベルの低いプロファイル変化が得られ、このsiRNAが細胞増殖や細胞周期に影響を与えることを示唆しています(図“通常のDNA合成における表現型”)。​​

生存細胞の色素排除

生細胞色素排除は様々なネガティブコントロールsiRNAの潜在的な細胞毒性効果を測定するために使用されていました。 AllStars Negative Control siRNAでトランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞は、生細胞と死細胞の数で類似した結果が得られました。対照的に、他のネガティブコントロールsiRNAでは細胞毒性の増加が観察されました(図“細胞毒性効果の増加なし”)。

細胞周期解析のためのDNA染色

細胞周期分布を測定するために細胞固定の後にDNA染色を用いました(細胞周期G1/G0、S、G2)。AllStars Negative Control siRNAのトランスフェクション後、各周期での細胞の比率はトランスフェクトされていない細胞のものと類似しています(図“正常の細胞周期分布”)。この結果はAllStars Negative Control siRNAが細胞周期に悪影響を及ぼさないことを証明しています。

RISCへの取り込みを評価するためのレポーター・コンストラクトのトランスフェクション

正確なネガティブコントロールRNAi実験のために、ネガティブコントロールsiRNAはRISC(RNA-Induced Silencing Complex)に組み込まれるべきです。 これは、コントロールsiRNAが遺伝子特異的なsiRNAと同様の生物学的プロセスを通過し、遺伝子特異的なsiRNAからのデータをネガティブコントロールsiRNAからのデータと比較でき、ターゲット遺伝子のノックダウンに起因するという結果を決定できることを意味します。

実験は以下のように行ないました。

レポーターコンストラクトは、Hisタグをもつ​蛍光レポーター遺伝子に融合したAllStars Negative Control siRNA 配列に相補的な人工的なsiRNAターゲット配列を含むように生成されました(図“ RISC取り込み実験のためのレポーターコンストラクト”)。
レポーターコンストラクトは AllStars Negative Control siRNA あるいは非相補的siRNAのどちらかと一緒にトランスフェクトされました。トランスフェクトしていない細胞も解析されました。
蛍光レポーター遺伝子の発現を検出するために蛍光顕微鏡およびFACSを行ないました。 ウェスタンブロット解析は、Hisタグを介して融合タンパク質の発現を検出するために実施しました。

レポーター・コンストラクトと非相補的siRNAのコトランスフェクションは、蛍光タンパク質とHisタグの強い発現をもたらしました。 コンストラクトをAllStars Negative Control siRNAとコトランスフェクトした場合には、siRNAは相補配列からの発現をノックダウンし、その結果、蛍光レポーター遺伝子、Hisタグ、およびsiRNAターゲット配列をコードする全mRNA転写物の分解が生じました。mRNA分解は融合タンパク質のノックダウンを引き起こします(図“ AllStars Negative Control siRNAのRISCへの取り込み”および“AllStars Negative Control siRNAのRISCへの取り込みを示すウエスタンブロット解析”)。クローニング実験によりAllStars Negative Control siRNAはRISCに取り込まれることが確認されています。

原理

全てのRNAi実験でネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトすることが重要です。ネガティブコントロールでの結果を未処理の細胞での結果と比較しなければなりません。遺伝子発現および表現型が未処理の細胞とネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞において類似していることが理想です。ネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞で発現あるいは表現型の変化が観察された場合には、これらの変化はトランスフェクション操作あるいはsiRNAの毒性や配列の相補性がないことなどによる非特異的なものです。非特異的な効果は確実なRNAi/miRNA結果を確保するために最小限でなくてはなりません。

ネガティブコントロールでの結果は実験している遺伝子特異的なRNAi/miRNAによる結果と比較することもできます。ネガティブコントロール処理したサンプルはsiRNA/miRNA配列が違うだけで同じ生物学的な過程を経ているため、この両者を比較することにより研究者は標的遺伝子のノックダウンが遺伝子発現や表現型へ効果を及ぼしたかを正確に判断することができます。

操作手順

AllStars Negative Control siRNAを用いた実験結果は以下のように利用できます:

実験設定が非特異的な効果を引き起こしたかどうかを決定するために、トランスフェクトしていない細胞での結果と比較
標的遺伝子のノックダウン効果を正確に判定するため、遺伝子特異的なsiRNAでの結果と比較
miRNA mimic 実験では、ターゲットのダウンレギュレーション効果を特定するために、遺伝子特異的 miRNA mimicsでの結果と比較
アプリケーション
すべてのルーチンRNAi実験
RNAiの開始実験
RNAiを利用したハイスループットスクリーニング
miRNA mimicトランスフェクションを含む実験
Feature
Specifications
Design Predesigned/validated by Affymetrix GeneChip Array and cell-based assays
Format Tube
Modification Yes
Scale or yield 5 nmol, 20 nmol
Species Human, mouse, rat
Target sequence provided No

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