ほぼすべての哺乳動物細胞タイプで細胞シグナル伝達活性の高感度測定用

  • 一度の実験で複数のパスウェイを解析
  • 即導入が可能なレンチウイルスにより、特別な準備は不要
  • ほとんどのタイプの哺乳動物細胞に導入可能
  • 非分裂細胞、幹細胞、分化細胞に導入可能
  • 一過性の実験、あるいは発現安定細胞株のレポーター構築に使用可能

Cignal Finder Lenti Reporter Arrayは即導入が可能なレンチウイルス粒子で、ほぼすべての哺乳動物細胞タイプで細胞シグナル伝達活性を測定することができます。Cignal Finder Lenti Reporter Arrayを用いて、10種類のシグナルパスウェイが包括的に解析できます。パスウェイ活性を同時にスクリーニングすることにより、関連するパスウェイを迅速に特定し、さらなる分析を行なえます。Cignal Finder Lenti Reporter Arrayは特定の遺伝子や薬剤により変化したパスウェイを確定します。

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Cignal Finder Lenti Reporter Array
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336831 CLA-002L ¥510,000
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Cignal Finder Lenti Reporter Arrays は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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Cignal Lenti Reporter操作手順|Cignal Lenti Reporter Assay|Cignal Finder Lenti Reporter Arrays|
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原理

各アレイは10種類のCignal Lenti Reporter Assayと2種類のコントロールで構成され、即導入可能なチューブフォーマットで提供します。Cignal Finder Lenti Reporter Arrayは、転写因子レポーターテクノロジーとレンチウイルスのデリバリー能力を組み合わせたものです。

Cignal Lenti Reporter Assayは、レポーター遺伝子(ホタル・ルシフェラーゼ)を発現させるために、特定の転写因子の結合部位と基本的なプロモーターエレメントが複数回繰り返されています。

レンチウイルスは、非分裂細胞を含むほとんどすべての哺乳動物細胞において、レポーターコンストラクトを導入する最も効果的な手段の一つです。導入されたレンチウイルスレポーターコンストラクトは、細胞のゲノムDNAに組み込まれ、レポーター遺伝子の安定した長期的な発現を実現します。

これらのレポーターは、パスウェイ活性を評価する機能ゲノミクスや創薬研究において、非常に強力なツールです。候補薬剤、遺伝子ノックダウン(siRNA使用)、過剰発現(発現ベクターによる)、ペプチドによりパスウェイが活性化あるいは阻害される場合は、ルシフェラーゼレポーター活性が変化し、これを定量的かつ迅速に測定することができます。

安全性

Cignal Finder Lenti Reporter Arrayに含まれているCignal Lenti Reporter Assayは即導入が可能で、自己増殖能がなく、HIVベースのVSV-G偽型のレンチウイルス粒子です(図“Cignal Lenti Reporter Assay”および表“Cignal Lenti Reporter Assayの特長”)。Cignal lentiviral particleは安全にご使用いただけます。これらは、Risk Group Level 2(RGL-2)の生物として取り扱うことを推奨します。取扱い及び廃棄物の汚染除去は、RGL- 2ガイドラインに従ってください。BSL- 2の作業環境を作成するための要件詳細については、U.S. Department of Health and Human Services publication Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th editionに記載されています。

これらのベクターで設計されているバイオセーフティの特長は以下の通りです:

標的細胞のゲノムDNAへの伝達および組み込み後にレンチウイルスコンストラクトの自己不活性化を確実に行なうために、3'LTRのU3部分のプロモーター/エンハンサー領域を欠失。 
Cignal Lenti Reporter Assayとプラスミド発現するパッケージングタンパク質は有意な相同配列をもたず、組み換えの可能性を最小限に抑える。 
HIV-1遺伝子(gag、pol、rev)はパッケージングシグナルを欠くパッケージングプラスミドから発現されるため、HIV-1遺伝子のいずれも形質細胞で発現されない。したがって作製されたレンチウイルス粒子は複製機能を有さない。 
病原性遺伝子(vpr、vif、vpu、nef)はCignal Lenti Reporter Assayに存在しない。

Cignal Lenti Reporter Assayの特長
特長 機能
RSV-5' LTR:Hybrid Rous Sarcoma Virus(RSV) エンハンサー/プロモーター・U5 LTR(long terminal repeat) ウイルスパッケージングの許可とウイルスmRNAの逆転写
Psi:Packaging signal ウイルスのパッケージングを行なう
RRE:Rev応答エレメント ウイルス転写産物のパッケージングに関与する
Cppt:セントラルポリプリン配列 導入されたウイルスゲノムの核移行および組み込みに関与する
レポーター遺伝子(ホタルルシフェラーゼまたはGFP) 転写の定量化
hPGK: human phosphoglycerate kinase eukaryotic promoter (ホスホグリセリン酸キナーゼの真核細胞プロモーター) 哺乳動物の選択マーカー(ピューロマイシン)を高レベルで発現
PuroR: ピューロマイシン耐性遺伝子 哺乳動物細胞の選択に使用
SIN/3' LTR:3'自己不活性化LTR(long terminal repeat) 生物学的安全性の理由から、ウイルスパッケージングを許可するが5' LTRを自己不活性化するように、3' LTRを改良。 エレメントには効率的な転写反応の終了のためのポリアデニル化シグナルも含む
f1 ori: f1 origin of replication 真核細胞内でプラスミドのエピソーム複製が可能
AmpR: ampicillin resistance gene 大腸菌でプラスミドの選択が可能
TRE:Transcription response element 特定の転写因子によるレポーター遺伝子発現の制御が可能
TATA box 最小プロモーターとして作用

 

操作手順

Cignal Finder Lenti Reporter Arrayは、レンチウイルスをさらに生成または増殖することなく、遺伝子導入をすぐに行なえます。これらのベクターは、トランスフェクト困難な細胞での一過性のシグナル伝達研究、または特定のパスウェイの安定細胞株の構築に適しています(フローチャート“Cignal Lenti Reporter操作手順”)。

本操作は簡単な3ステップで構成されています:

Cignal Finder Reporter Arrayおよびテストしたい核酸を細胞にトランスフェクトします。
目的のsiRNA、タンパク質、ペプチド、低分子で処理します。 
ルシフェラーゼ活性アッセイを用いてレポーター定量を行ないます。
トランスフェクト困難な細胞株で一過性のパスウェイ制御研究

標的細胞にCignal Lenti Reporter Assayを導入する。レンチウイルスの融合を確実にするために細胞をさらに24~48時間培養する。その後、目的の試薬(siRNA、shRNA、化学物質、ウイルス発現ベクター、タンパク質、ペプチド)で細胞を処理する。処理後18~36時間にレポーターアッセイ(ホタル・ルシフェラーゼ)を行なう(アッセイ時間は処理条件により異なる”)。

パスウェイ感受性細胞株の構築

標的細胞にCignal Lenti Reporter Assayを導入する。導入後、均質な細胞集団が得られるようピューロマイシン選択条件下で培養する。必要に応じて、クローン化したパスウェイ特化細胞株を単離するために、シングルセルのクローニングを行なう。これらのパスウェイ感受性細胞株は、スクリーニングや作用メカニズムの研究といったセルベースアッセイのプラットフォームとして役立つ。

アプリケーション

Cignal Finder Lenti Reporter Arrayは機能性ゲノムや創薬において強力なツールであり、ほぼすべての哺乳動物細胞タイプで細胞シグナル伝達活性を測定することができます。これらはsiRNA、タンパク質、低分子化合物の生物学的影響を評価するのに最適です。

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パンフレット
1
For measurement of signaling pathways in any mammalian cell
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キットハンドブック
1
For lentiviral-based cell signaling activity assays
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安全データシート
1