貴重なRNA サンプルから膨大な数のリアルタイムPCR 解析を実現
  • 多数の定量PCR解析やアーカイブを実現する高いcDNA収量
  • cDNAおよび転写物の全領域から均一に増幅
  • 至適化された試薬で迅速かつ簡単な実験操作

QuantiTect Whole Transcriptome Kit では、限られた量のRNAから増幅および逆転写反応により高収量のcDNAのを得ることができ、リアルタイムPCRによる多数の遺伝子発現解析が可能になります。至適化済みのプロトコールにより迅速かつ簡単に操作できます。本キットは、全トランスクリプトーム増幅(whole transcriptome amplification;WTA)のための酵素および試薬のセットです。Phi29 ポリメラーゼテクノロジーの画期的な改良により、わずか1 ng のRNAから最高40 μg のcDNAが得られます。このポリメラーゼの画期的な高い伸長性により、均一に増幅されたターゲットを含むcDNAが合成され、リアルタイムPCRで信頼性のある遺伝子発現解析を実現します。

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QuantiTect Whole Transcriptome Kit (25)
For 25 x 50 µl reactions: 25 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 25 µl Ligation Enzyme 1, 25 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 25 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 730 µl REPLI-g Midi Reaction Buffer
207043
¥104,000
QuantiTect Whole Transcriptome Kit (100)
For 100 x 50 µl reactions: 100 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 100 µl Ligation Enzyme 1, 100 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 100 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 2 x 1.45 ml REPLI-g Midi Reaction Buffer
207045
¥335,000

QuantiTect Whole Transcriptome Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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一定したcDNA収量|5' 領域および 3' 領域を均一に増幅|操作手順|信頼できるリアルタイムPCR解析|全トランスクリプトーム増幅|転写物プロファイルの保持|
QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて異なる血液サンプルからのトータルRNA(10 ng)を2 時間あるいは8 時間増幅した。cDNAの収量は、PicoGreen試薬を用いて測定した。|QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を増幅した。このcDNA 10 ng、β-actinに特異的なプライマー、QuantiTect SYBR® Green PCR Kit を用いてリアルタイムPCRを行なった。β-actin転写物の5'領域と3'領域に相当する増幅産物は、リアルタイムPCRで同等のCT 値で検出されたことから、QuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物の全領域を均等に増幅することが分かる。|cDNAは、精製RNAから3段階の反応により増幅される(逆転写、ライゲーション、全トランスクリプトーム増幅)。|replicateのRNA サンプル(各10 ng)をQuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて増幅した。その後、Mx3005P システム上でcDNA 10 ng とQuantiFast Probe PCR Kit を用いて表示したターゲットのリアルタイムPCRを行なった。曲線が重なっていることは、再現性の高い全トランスクリプトーム増幅であることを示唆している。ACTB:β-actin、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1。|RNAテンプレートからまずcDNA を合成し、その後ライゲートする(未提示)。REPLI-g DNAポリメラーゼがDNAテンプレート上を移動し相補鎖を置換する。置換したDNA鎖が複製のテンプレートになり、cDNA が高い収量で複製される。|QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を2 時間(WTA 2 h)あるいは8 時間(WTA 8 h)増幅し、続いて10 ng のcDNAを用いて5 種類のターゲットをリアルタイムPCRで解析した。コントロールとして、Sensiscript RT Kit(Non-WTA)を用いてRNAを逆転写し、RT反応液の1/5をリアルタイムPCR に用いた。リアルタイムPCR はQuantiTect Probe PCR Kit を用いて行なった。[A] 5 種類の転写物の相対的な遺伝子発現レベル(HPRT1 で標準化した)は、重なった測定点が示すようにWTA 2 hWTA 8 hそしてNon-WTAサンプルにおいて同じ程度である。[B] Non-WTAサンプル(X軸)のΔCT値に対してWTA 8 hサンプル(Y 軸)のΔCT値(各ターゲットのCT 値からインターナルリファレンスであるβ-actinのCT 値を差し引いた値)をプロットしたグラフは高い直線性を示している。 [A]および[B]のデータはQuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物プロファイルを保持していることを証明している。TP53:Tumor protein p53、NFKB1:nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1、TBP:TATA box binding protein、TNFRSF6B:tumor necrosis factor receptor superfamily、member 6b、decoy。|
パフォーマンス

QuantiTect Whole Transcriptome Kit による全転写物の均一な増幅は、信頼できる遺伝子発現解析において必須条件です。全てのmRNA転写物が5'領域および3'領域の両方で均一に増幅されます(図 "5’領域および3’領域を均一に増幅")。QuantiTect Whole Transcriptome Kit でWTA増幅したcDNA と、逆転写酵素で調製した増幅なしのcDNAを比較した結果を図 "転写物プロファイルの保持"に示しています。これは、転写物プロファイルが保持されていることを証明しています。

最高40 μg までの高収量cDNAが再現性良く得られます(図 "一定したcDNA収量")。この特長によりリアルタイムPCR 解析を何回も行なうことが可能で、CT 値も一定しています(表および図 "信頼できるリアルタイムPCR解析")。さらにcDNAはRNAよりも安定であるため、将来行なう研究実験用に、安全に保存することができます。

リアルタイムPCR用に高収量でcDNA を産生
スタートサンプル 増幅時間 増幅産物の一般的な収量 解析可能なリアルタイムPCR解析の回数*
10 ng RNA 2 時間 最高 10 µg/反応 1000
10 ng RNA 8 時間 最高 40 µg/反応 4000
* QuantiTect Kit を用いた1回の全トランスクリプトーム増幅反応で得られるcDNAから解析可能なリアルタイムPCR解析の回数。WTA反応を行なわない場合には、10 ng のRNA から1回しか信頼できるリアルタイムRT-PCR解析ができない。
原理

使用可能な生体サンプルが微量の場合、遺伝子発現プロファイル解析が制限されることがあります。QuantiTect Whole Transcriptome Kitを用いることで、微量かつ貴重なサンプルから膨大な数のリアルタイムPCR 解析が可能になります。QuantiTect Whole Transcriptome Kitは、わずか1 ng のRNA あるいは約50個の細胞に相当するRNAからの全トランスクリプトーム増幅用に至適化されています。RNAの品質および目的の転写物の量によっては、さらに少量のRNAでも使用できます。

QuantiTect Whole Transcriptome Kitには、RNAサンプル中の全転写物の増幅のための逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、至適化済みバッファーと試薬が含まれています。本キットは、バイアスのない配列増幅のために、実証済みのREPLI-g テクノロジーを用いたcDNA合成を組み込んでいます。REPLI-g 増幅は、伸長性が高いDNAポリメラーゼを用いて等温でゲノム増幅ができるMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーを利用しています(図 "全トランスクリプトーム増幅)。本テクノロジーは転写物の全領域(5'領域からでも)からバイアスのない均一な増幅を実現するので、リアルタイムPCRに最適な高収量のcDNAが得られます。

操作手順
わずか3 ステップの操作手順でトータルRNAからトランスクリプトームの全体像を表すcDNAを高い収量で調製できます(フローチャート "操作手順")。まずT-Script Enzyme およびrandom プライマーとoligo-dT プライマーを含む至適化済みの逆転写反応ミックスを用いてRNAをcDNAに逆転写します。合成したcDNAを効率の高いライゲーションミックスによりライゲートし、実証済みのREPLI-g テクノロジーをベースにした増幅ミックスを用いて増幅します。
アプリケーション

QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて合成したcDNAはQuantiFastやRotor-Gene Kitsを用いたリアルタイムPCR解析に使用でき、将来行なう解析のために長期保存することもできます。このcDNAはマイクロアレイ解析には適切ではありません。少量あるいは貴重なサンプルからの全ゲノム増幅に、QIAGENはREPLI-g kitsを提供しています。配列によるバイアスは最小限で均一に増幅されるので、増幅したDNAはジェノタイピングやCGH(Comparative Genome Hybridization)のようなアプリケーションに最適です。

Feature
Specifications
Amplification Whole total RNA
Applications Real-time PCR, gene expression analysis
Maximum input volume 5 µl total RNA
Minimal pipetting volume needed 1 µl
Reaction time 5 hours or 11 hours
Reaction volume 50 µl
Samples per run; throughput Mid
Starting amount of total RNA >10 ng purified total RNA
Starting material Purified total RNA
Technology Reverse transcription followed by ligation and multiple displacement amplification (MDA)
Yield 10 µg or 40 µg cDNA

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FAQ
25
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キットハンドブック
2
For preparation of cDNA from total RNA by whole transcriptome amplification
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全トランスクリプトーム増幅によりトータルRNAからcDNAを調製
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