QuantiFast Multiplex PCR Kits

QuantiFast Multiplex Kitsは2ステップリアルタイムRT-PCRで全PCR時間を最高50％まで短縮する（40サイクル、QuantiTect Multiplex Kitsと比較）。I： iCycler iQ、 L1：LightCycler 480、L2：LightCycler 2.0、A1：ABI PRISM 790、A2：Applied Biosystems 7500 Fast System、M：Mx3005P。
|10⁸ コピーのβ-actin（挿入図）と、10⁶ から10コピーのRPS27A（リボソームタンパク質）を含むDNAテンプレートを用いてApplied Biosystems 7500 Fast System上でduplicate反応を行なった。[A] QuantiFast Multiplex PCR +R Kit を用いた場合には、[B] A_II社のduplex PCRキットに比べて感度が明らかに高く、迅速サイクリングモードのサイクラーで10コピーターゲットを検出でき、テンプレートを10⁶ 倍の希釈範囲で定量できた。|[A] RPS27A（リボソームタンパク質）、[B] GAPDH（ハウスキーピング遺伝子）、[C] UBC（ハウスキーピング遺伝子）について、Primer ExpressでデザインしたTaqManアッセイとQuantiFast Multiplex PCR +R Kitを用いてLightCycler 480上でtriplexおよびsingleplexPCRを行なった。テンプレートはHeLa細胞のcDNA（10 ng、1 ng、0.1 ng）を用いてtriplicateで行なった。Triplex PCR（色つきの曲線）とsingleplex PCR（グレーの曲線）のC_T 値が類似していることから、様々な発現量のターゲットの解析でQuantiFast Multiplex PCR +R Kitを用いて信頼できるtriplex PCRが可能なことを証明している。|QuantiFast Multiplex PCR +R Kit とPrimer ExpressでデザインしたTaqManアッセイを用いてApplied Biosystems 7500 Fast System上で4plexリアルタイムPCRを行なった。Ramos細胞株のcDNA 10 ngを用いてtriplicate反応を行なった。|[A] QuantiFast Buffer中のQ-Bondは、短い一本鎖化したDNAへのDNAポリメラーゼの結合アフィニティーを増大させるため、プライマーのアニーリング時間を数秒間に短縮できる。さらにDNAの融解をサポートするユニークなバッファー組成が、変性およびエクステンション時間を短縮する。[B] Q-Bond が存在しないと、プライマーとポリメラーゼが連続的にテンプレートに結合するのでプライマーのアニーリングに時間がかかる。|QuantiFast Multiplex PCR Kitsは、簡単な操作でマルチプレックスリアルタイムRT-PCRを実現する。汎用されている方法に比べて、本キットはプライマー、プローブ、Mg²⁺、Taq DNA polymeraseの濃度に対する至適化が不要で、リファレンス遺伝子に比べてターゲット遺伝子のコピー数が少ないアッセイでも同様。|[A] NH₄⁺ イオンは非特異的なプライマーのテンプレートへのアニーリングを防ぐ。[B]画期的なPCR添加物であるFactor MP は、テンプレート周辺でのプライマー濃度を高める。K⁺ や他の陽イオンと共に、Factor MPは特異的に結合したプライマーを安定化し、HotStarTaq Plus DNA Polymeraseによる効果的なプライマーエクステンションを可能にする。|QuantiFast Multiplex PCR +R Kitを用いて、Applied Biosystems 7500 Fast System上でt（8；14）染色体転座とGAPDH用のアッセイのためのduplexおよびsingleplex PCRを行なった。テンプレートとしてRamos 細胞株のゲノムDNA（10 ngから0.625 ngの2倍希釈）を用いてQuadruplicate反応を行なった。[A] singleplexと[B] duplex反応の両方でテンプレートの希釈に伴いC_T 値は1 C_Tずつ直線性を持って増大したことは、本キットがテンプレート量の微量な差異も正確に定量できることを証明している。|