PyroMark PCR Kit

パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅
  • 様々なサンプルからゲノムDNAおよびBisulfite変換DNAを高い特異性で増幅
  • パイロシークエンス解析用に至適化済みのキット
  • 至適化不要で高収量のPCR産物
  • 室温でセットアップできる簡便なマスターミックス
  • 至適化済みのプロトコール

PyroMark PCR Kitはパイロシークエンス解析用に特別に至適化され、DNAテンプレートを変異検出、SNP検出、メチル化解析、シークエンシングなど様々なアプリケーション用に高い特異性で均一に増幅します。本キットは、特異性の高い増幅用に至適化済みのPyroMark Reaction BufferとHotStarTaq DNA Polymeraseからなる簡便なマスターミックスフォーマットでお届けします。さらに増幅困難なテンプレート(GCリッチなど)用に最適なQ-Solutionも入っています。PyroMark PCR KitにはまたCoralLoad Concentrateが同梱されており、パイロシークエンス解析において信頼できる結果が得られます。CoralLoad Concentrateには2種類のマーカー色素が入っているので、パイロシークエンス解析を行なう前にPCR産物をすぐにゲルにロードしチェックできます。

製品名 Product no. Cat. no. List price:
 
 
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PyroMark PCR Kit (200)
For 200 reactions: 2x PyroMark PCR Master Mix (includes HotStarTaq DNA Polymerase and optimized PyroMark Reaction Buffer containing 3 mM MgCl2 and dNTPs), 10x CoralLoad Concentrate, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2, and RNase-Free Water
978703
¥38,000
PyroMark PCR Kit (800)
For 800 reactions: 2x PyroMark PCR Master Mix (includes HotStarTaq DNA Polymerase and optimized PyroMark Reaction Buffer containing 3 mM MgCl2 and dNTPs), 10x CoralLoad Concentrate, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2, and RNase-Free Water
978705
¥126,000

PyroMark PCR Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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CoralLoad Concentrate|パイロシークエンス法に至適化されたPCR|PyroMark PCR Kitで優れた結果|プライマーのアニーリングにおける特異性が増加|
CoralLoad Concentrate は2種類のマーカー色素を含み[A] 、PCR産物を即ゲルにアプライでき、DNAの移動を簡単に可視化できる[B] 。|PyroMark PCR Kit は、特異性の高い非常に効率的な増幅を可能とする。そのため、[B] の標準的PCRと比べて、 [A]本キットでは、パイログラムのピークが高く、信頼性の高いパイロシークエンス結果が得られる。|テンプレートDNA(10 ng)を PyroMark PCR Kitと、Suppliers R, I、AIIのPCRマスターミックスを用いて並行して増幅した。Cyclin A1、BARHL1、MINT1、DNMT3b に特異的なプライマーはPyroMark Assay Design Software 2.0を用いて設計し、アニーリング温度は48.4℃~60.1℃の範囲の温度勾配を使用した。PyroMark PCR Kit は、他のマスターミックスよりも常に高収量のアンプリコンを生産し、非特異的なPCR産物は少なく、ダウンストリームのパイロシークエンス解析から信頼できる結果を得られた。M :50 bp ラダー|K+ はDNA バックボーンのリン酸基(P)に結合し、テンプレートへのプライマーアニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基(B)間の水素結合に相互作用するため、主にミスマッチの塩基間の弱い水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマーテンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。|
パフォーマンス
最適な割合のカリウムとアンモニウム塩を含有するPyroMark PCR Master Mixは、プライマーとテンプレートの特異的なアニーリングを促進すると同時に非特異的なアニーリングを抑制します。テンプレート量が非常に少ない場合でも、最大収量の特異的産物が得られます(図 "PyroMark PCR Kitで優れた結果")。このように至適化されたテンプレートの増幅によってPyrogramのピークが高くなり、パイロシークエンス法の結果がさらに信頼できるものとなります(図 "パイロシークエンス法に至適化されたPCR")。

原理
PyroMark PCR Master Mix

PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅を可能にします。全てのPCRサイクルのアニーリングステップ中、画期的なバッファー成分により、特異的なプライマー結合の比率が非特異的な結合に比べて高くなります。ゲノムDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、主に3種類の塩基で構成されるDNAがつくられます。このPCRバッファーは、KClと(NH4)2SO4のユニークな配合比により、従来のPCRバッファーに比べ幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密なプライマーアニーリング条件を実現します。塩をバランスよく配合したPyroMark PCR Kitのユニークなマスターミックスは、特異的なプライマー結合を確実にし、ミスプライミングを防ぎます。この特殊な配合組成は、ビオチン化プライマーの過剰な蓄積も防ぎ、パイロシークエンス反応を妨害する可能性があるアーティファクトの発生を最小限に抑えます。高収量の特異的なPCR産物が得られることで、パイロシークエンス法の結果が信頼できるものになります。 

各PCRサイクルのアニーリングステップの間、このバッファー組成により、プライマーの非特異的結合に対する特異的結合の比が高くなります(図 "プライマーのアニーリングにおける特異性が増加")。本製品のPCRバッファーは、独自のバランスでKClと(NH4)2SO4を含んでおり、従来のPCRバッファーと比べて幅広い範囲のアニーリング温度とMg2+ 濃度条件で、厳密なプライマーアニーリングが可能になります。アニーリング温度やMg2+ 濃度を変化させてのPCR最適化実験は、通常は必要ありません。

HotStarTaq DNA Polymerase

マスターミックス中のHotStarTaq DNA Polymeraseは、QIAGENの組み換えTaq DNA Polymerase(94 kDa)を改良しています。HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により低温でのミスプライムによる増幅産物やプライマーダイマーの形成を抑制できます。HotStarTaq DNA Polymerase は、95 ℃、15分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。HotStarTaq DNA PolymeraseはPCRの特異性を高め、特異性の高いPCR産物の収量が増加します。全ての反応成分は室温で混和できるのでPCRセットアップが迅速かつ簡単に行なえます。

Q-Solution

PyroMark PCR Master Mixには画期的なPCR添加剤であるQ-Solutionが添付されており、DNAの変性環境を改善することで、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬により、高度な二次構造を持つテンプレートやGCリッチなテンプレートなどの増幅反応を促進します。DMSOのような汎用されているPCR添加物と異なり、Q-Solutionはどのようなプライマーテンプレートでも一定の濃度で作用し、毒性もなく、PCR純度は保証されています。Q-Solution存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

CoralLoad Concentrate

2種類のマーカー色素とゲルローディング試薬が入った CoralLoad Concentrateがキットに添付されています(図 "CoralLoad Concentrate")。CoralLoad Concentrateを用いた際は、PCR産物を直接アガロースゲルにロードでき、ゲルローディングバッファーおよびマーカー色素を前もって添加する必要がありません。CoralLoad ConcentrateをPCRに添加しても、増幅感度や特異性に影響しません。CoralLoad Concentrate存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

 

操作手順

PyroMark PCR Kit は、パイロシークエンス解析用に至適化されたDNAテンプレートのPCR増幅を実現します。テンプレートDNAを便利なPyroMark PCR Mastermix、Q-Solution、CoralLoad concentrate、および増幅プライマー(一方はビオチン化されているもの)と混合します。HotStarTaq DNA Polymerase は室温では不活化されているため、氷上で反応セットアップを行なう必要はありません。

アプリケーション
パイロシークエンス法は様々な分野でますます重要になってきています。パイロシークエンス法は遺伝子変異やエピジェネティックな変異のパワフルで多様な解析を可能にし、病原体における薬剤耐性や遺伝子発現制御におけるエピジェネティックなDNAメチル化の役割、家畜における特定の表現型のための遺伝子マーカー、法医学サンプルのミトコンドリアDNA多型を調べることが可能です。PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析のための信頼できる特異性高いテンプレートアンプリコンを作製するために必要な試薬です。

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クイックスタートプロトコール
1
キットハンドブック
2

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パイロシークエンス(Pyrosequencing)解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅用
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安全データシート
2
References
0
画像
Ready-to-load PCR buffer
CoralLoad Concentrate
CoralLoad Concentrate は2種類のマーカー色素を含み[A] 、PCR産物を即ゲルにアプライでき、DNAの移動を簡単に可視化できる[B] 
PCR amplification optimized for Pyrosequencing analysis
パイロシークエンス法に至適化されたPCR
PyroMark PCR Kit は、特異性の高い非常に効率的な増幅を可能とする。そのため、[B] の標準的PCRと比べて、 [A]本キットでは、パイログラムのピークが高く、信頼性の高いパイロシークエンス結果が得られる。
Superior PCR results with PyroMark PCR Kit
PyroMark PCR Kitで優れた結果
テンプレートDNA(10 ng)を PyroMark PCR Kitと、Suppliers R, I、AIIのPCRマスターミックスを用いて並行して増幅した。Cyclin A1、BARHL1、MINT1、DNMT3b に特異的なプライマーはPyroMark Assay Design Software 2.0を用いて設計し、アニーリング温度は48.4℃~60.1℃の範囲の温度勾配を使用した。PyroMark PCR Kit は、他のマスターミックスよりも常に高収量のアンプリコンを生産し、非特異的なPCR産物は少なく、ダウンストリームのパイロシークエンス解析から信頼できる結果を得られた。M :50 bp ラダー
NH4+ and K+ cations in QIAGEN PCR buffers increase specific primer annealing
プライマーのアニーリングにおける特異性が増加
K+ はDNA バックボーンのリン酸基(P)に結合し、テンプレートへのプライマーアニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基(B)間の水素結合に相互作用するため、主にミスマッチの塩基間の弱い水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマーテンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。