qBiomarker Copy Number PCR Arrays

|細胞、組織、血液、およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルなどの研究用試料からDNA を分離。DNA をqBiomarker SYBR^® Mastermix と混和し、1 サンプルを1 アレイにピペットで分注する。各アレイプレートには、23 あるいは95 種類の遺伝子座に特異的なアッセイ、ならびにqBiomarker Multi-Copy Reference Copy Number PCR Assay が4replicateで入っている。リアルタイムPCR 装置でプレートのプログラムを実施し、ウェブベースの無料データ解析ツールを使用してデータを解析する。|96ウェルプレートフォーマットは23遺伝子とMRefに関して4 replicateでコピー数アッセイを実現する。|384ウェルプレートフォーマットは4サンプルに関して23遺伝子とMrefアッセイ、あるいは1サンプルに関して95遺伝子とMrefアッセイのコピー数解析を実現する。全てのアッセイは4 replicateで提供。|リアルタイムPCR装置Rotor-Gene Qを使用する場合、Rotor-Discフォーマットを使用すると、1サンプルに関して23遺伝子とMRefアッセイの解析が可能。|X 染色体上にあるARをターゲットにしてデザインされたqBiomarker Copy Number Assaysを用いて、1コピー（XY, Coriell NA13619）、2コピー（XX, Coriell NA01921）、3コピー（XXX, Coriell NA03623）、4コピー（XXXX, Coriell NA11226）のX 染色体を含む4 種類の細胞株DNAでテストした。染色体異常は、細胞遺伝学的方法によって同定済みである。DNA インプット量を正規化するために、ヒトゲノムにある安定なマルチコピー領域をターゲットにしたコントロールアッセイを用いた。XX（Coriell NA01921）を2コピー数のリファレンスとして用いて、ΔΔCT 法により遺伝子コピー数を計算した。各アッセイは、それぞれのサンプルで4 replicate 反応を行ない、t検定を実施した。|X 染色体上にあるMECP2をターゲットにしてデザインされたqBiomarker Copy Number Assaysを用いて、1コピー（XY, Coriell NA13619）、2コピー（XX, Coriell NA01921）、3コピー（XXX, Coriell NA03623）、4コピー（XXXX, Coriell NA11226）のX 染色体を含む4 種類の細胞株DNAでテストした。染色体異常は、細胞遺伝学的方法によって同定済みである。DNA インプット量を正規化するために、ヒトゲノムにある安定なマルチコピー領域をターゲットにしたコントロールアッセイを用いた。XX（Coriell NA01921）を2コピー数のリファレンスとして用いて、ΔΔCT 法により遺伝子コピー数を計算した。各アッセイは、それぞれのサンプルで4 replicate 反応を行ない、t検定を実施した。|腫瘍DNAのように多くの増幅および／または欠失を有するゲノムDNAサンプルでは、リファレンス遺伝子自体がコピー数の変化を受けていないことを確認するために、それらのシングルコピーリファレンス遺伝子を検証する必要がある。マルチコピーリファレンスアッセイの利点は、2種類の一般的ながん細胞株におけるRNase Pの相対コピー数の測定において実証されている。DNAインプットの正規化コントロールとしてqBiomarker Multi-Copy Reference Copy Number PCR Assayを用いて、ΔΔC_T法により、2 種類の乳がん細胞株（SKBR3およびMCF7）のゲノムDNAでDNAの正常なゲノムコピー量あたりのRNase Pの絶対コピー数の平均値を測定した。ReferenceゲノムDNAの正常ゲノムあたりのRNase Pの絶対コピー数は2であると考えられる。SKBR3およびMCF7の両方でのRNase Pのコピー数が大幅に変化していることは、このリファレンス遺伝子が、これらのサンプルの正規化に信頼性のないことを示している。|腫瘍細胞株DNA（SKBR3）とリファレンスゲノムDNA（Promega社）を異なる比率（SKBR3細胞が100 ％、87.5 ％、75 ％、50 ％、25 ％、12.5 ％、および0 ％）で混和し、リファレンスとしてMRefアッセイ（A）またはRNase Pアッセイ（B）のいずれかを用いて、GRB7（SKBR3で有意に増幅される遺伝子）の遺伝子コピー数をDNAミックスで調べた。リファレンスDNAでのGRB7コピー数は2であると考えられた。87.5 ％、75 ％、50 ％、25 ％、および12.5 ％の割合で混和したサンプルでの予想されるGRB7遺伝子コピー数は、100 ％ SKBR3 gDNAサンプルのGRB7遺伝子のコピー数と、SKBR3 gDNAとリファレンスゲノムDNAの混合比に基づいて計算した。|