反応あたり50 ng ~ 2 μg のRNA を用いた逆転写反応(エンドポイントPCR用)

  • アフィニティーが高い酵素による高収量cDNA
  • わずか10コピーのテンプレートも高感度で検出
  • 追加のRNase H分解は不要
  • 煩わしいピペッティング操作なしの迅速で簡単な製法
Omniscript Reverse Transcription(RT)Kitは、各反応あたり50 ngから2 µgのRNA量を用いた逆転写用に特別にデザインされています。RNAへのアフィニティーが高いOmniscript Reverse Transcriptaseは、他の逆転写酵素と比較して非常に優れた性能を示し、低いコピー数のテンプレートでさえ高感度なRT-PCRを実現します。Omniscript RT KitにはOmniscript Reverse Transcriptase、dNTPs、至適化済みの反応バッファーが含まれています。プライマーを添加するだけで迅速かつ簡単にcDNAを合成できます。
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Omniscript RT Kit (50)
For 50 reverse-transcription reactions: 200 units Omniscript Reverse Transcriptase, 150 µl 10x Buffer RT, 100 µl dNTP Mix (contains 5 mM each dNTP), 1.1 ml RNase-free water
205111
¥35,000
Omniscript RT Kit (200)
For 200 reverse-transcription reactions: 800 units Omniscript Reverse Transcriptase, 4 x 150 µl 10x Buffer RT, 4 x 100 µl dNTP Mix (contains 5 mM each dNTP), 4 x 1.1 ml RNase-free water
205113
¥110,000

Omniscript RT Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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完全長のRT-PCR産物 — A|完全長のRT-PCR産物 — B|Omniscript Reverse Transcriptase製法|種々の逆転写酵素との比較|10コピー以上の高感度なRT-PCR|
表記の逆転写反応の温度でトウモロコシの葉から得られたトータルRNAを用いてRT-PCRを行なった。GC含有率の高いトウモロコシgl2転写物の1.2 kbフラグメントを増幅した。スタンダードOmniscript RTプロトコールを用いて、標準温度(37℃)および表記より高い反応温度で逆転写を行なった。|表記の逆転写反応の温度でトウモロコシの葉から得られたトータルRNAを用いてRT-PCRを行なった。GC含有率の高いトウモロコシgl2転写物の1.2 kbフラグメントを増幅した。スタンダードMMLV RNase H- RTプロトコール(Supplier L)を用いて標準温度(42℃)および表記の反応温度でRTを行なった。このスタンダードプロトコールでは、まず必要な主要変性ステップ、そして逆転写後推奨されているRNase H分解ステップを行なった。|Omniscript RT KitにはdNTPsと至適化済みの反応バッファーが同梱されているため即使用可能であり、RNAに対するOmniscript Reverse Transcriptaseの高いアフィニティーと相まって、高GC含量または複雑な二次構造のテンプレートの読み取りが実現している。この事前の至適化により、手間のかかるピペッティングやプレインキュベーションステップが不要となり、RNase Hによる追加の分解ステップも必要ない。|各社のプロトコールに従い、種々の逆転写酵素を用いて逆転写を行なった。反応に利用したHeLa細胞のトータルRNA量を図の上部に示した。QIAGEN Taq DNAポリメラーゼを用いて逆転写反応液の1/20量からPCR増幅を25サイクル行なった。1.7 kbのβ-Actinフラグメントを増幅した。 Omniscript::Omniscript Reverse Transcriptase(QIAGEN)、 MMLV RNase H–:モロニーマウス白血病ウイルス由来RNase H– reverse transcriptase(Supplier L)、 MMLV:野生型MMLV reverse transcriptase(Supplier L)、 AMV RNase H–:トリ骨髄芽球症ウイルス由来熱安定性RNase H– reverse transcriptase(Supplier L)、 AMV:野生型AMV reverse transcriptase(Supplier P)。|10~104コピーに相当する700 ntのin vitro転写物を含むテンプレート(トータルRNA量200 ng)を逆転写後、PCRを行なった。各逆転写反応液の1/4(2.5から2500 cDNAコピーに相当)を330 bpフラグメントの増幅に用いた。|
パフォーマンス

Omniscript Reverse Transcriptase (RT) の高いRNAアフィニティーによりコピー数の少ない転写物からでさえも、高効率および高感度のRT-PCR結果が得られるので(図"10コピー以上の高感度なRT-PCR")、温度あるいは反応条件の調整を行なわずに、複雑な二次構造を持つRNAでも、完全に読み取り、逆転写を実現します(図"種々の逆転写酵素との比較")。

その他の逆転写酵素では、GC含有率の高いRNA領域は逆転写が止まったりRNAテンプレートから解離したりする原因であり、またRNAのループ構造部分をスキップしてしまいます(図"完全長のRT-PCR産物 — B")。しかし、このような逆転写が困難なテンプレートも、QIAGENの逆転写酵素を使用すれば、逆転写が効率よく行なわれることが証明されています(図"完全長のRT-PCR産物 — A")。Omniscript RT Kitは、至適化なしで事実上問題なく逆転写が可能なキットです。

原理

RNAに対して高いアフィニティーを有するOmniscript Reverse Transcriptase(RT)は、どのようなテンプレートでも効率的で高感度の逆転写が可能であり、高収量のcDNAが得られます。dNTPsと至適化済みの反応バッファーが同梱されているため即使用可能であり、RNAに対するOmniscript RTの高いアフィニティーと相まって、高GC含量または複雑な二次構造のテンプレートの読み取りが実現しています。プライマーミックスは同梱されていなのでご注意ください。

Omniscript RTは、各反応あたり50 ngから2 µg のRNA量を用いた、あらゆる逆転写用に特別にデザインされています。多くのウイルスRNA調製にはキャリアRNAが存在するので、Omniscript RTは通常ウイルスRNAに最適な酵素です。比較実験においても、Omniscript RTは、幅広いRNAのスタート量で他の逆転写酵素より一定した優れた性能を示します。

Omniscript Kitsのロット間の再現性は、QIAGENの厳しい品質管理により保証されています。全てのOmniscript RT Kitsに添付されている至適化済みのBuffer RT、dNTPs、水はRNaseフリーの保証付きで、Omniscript RTの各ロットは、RT-PCRの再現性に関する多数の品質管理テストを受けています。

操作手順
Omniscript Reverse Transcriptaseの至適化済みの反応バッファーによって、手間のかかるピペッティングやプレインキュベーションステップが不要となり、RNase Hによる追加分解ステップも必要ありません(フローチャート"Omniscript Reverse Transcriptase製法")。
アプリケーション

Omniscript Reverse Transcriptaseは以下のようなアプリケーションに最適です。

  • エンドポイントPCR用cDNA合成
  • クローニング用二本鎖cDNA合成
  • RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
  • リニアRNA増幅
  • RNAの指数的増幅
  • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
  • マイクロアレイ用標識反応
  • プライマーエクステンションによる転写開始部位解析
Feature
Specifications
Applications RT-PCR, qRT-PCR, primer-extension, RACE analysis
Enzyme activity Reverse transcription
Mastermix No
Reaction type Reverse transcription
Real-time or endpoint Endpoint
Sample/target type RNA template
Single or multiplex Single
With/without hotstart Without hotstart

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キットハンドブック
2
Omniscript Reverse Transcriptase - For First-strand cDNA synthesis Two-tube RT-PCR
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各反応当たり50 ngから2 μgまでのRNAを用いたスタンダードな逆転写反応用
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