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HotStarTaq Master Mix Kit

どのようなPCRアプリケーションでも特異性の高い増幅を実現

  • 至適化なしに高いPCR特異性を実現
  • 反応セットアップが室温で可能
  • 即使用可能なマスターミックスフォーマットでピペッティング操作が減少

HotStarTaq Master Mixには、HotStarTaq DNA Polymerase、至適化が最小限で済む画期的なQIAGEN PCR Buffer、およびdNTPが含まれています。マスターミックスには全ての成分が含まれているので、ピペッティングステップとコンタミのリスクが減少し、スループット数と再現性が増加します。

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製品名 Cat. no. List price:
HotStarTaq Master Mix Kit (250 U)
3 x 0.85 ml HotStarTaq Master Mix (contains 250 units HotStarTaq DNA Polymerase, PCR Buffer with 3 mM MgCl2, and 400 µM of each dNTP)and 2 x 1.7 ml RNase-Free Water
 203443
¥34,500
HotStarTaq Master Mix Kit (1000 U)
12 x 0.85 ml HotStarTaq Master Mix (contains 1000 units HotStarTaq DNA Polymerase, PCR Buffer with 3 mM MgCl2, and 400 µM of each dNTP) and 8 x 1.7 ml RNase-Free Water
 203445
¥120,000
Hot StarTaq Master Mix Kit (2500 U)
1 x 25 ml HotStarTaq Master Mix (contains 2500 units HotStarTaq DNA Polymerase PCR Buffer with 3 mM MgCl2, and 400 µM of each dNTP) and 1 x 50 ml RNase-Free Water
 203446
¥254,000
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HotStarTaq Master Mix Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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HotStarTaq操作手順|卓越した性能|異なるプライマー／テンプレートシステムにおける高特異性|RT-PCR性能へのホットスタートの影響|高感度のシングルセルPCR|異なったマグネシウム濃度への適応|Multiplex PCRにおける特異的な増幅|プライマーアニーリングの特異性増大|
HotStarTaq操作は迅速かつ容易で最高の使いやすさを実現する。|ヒトゲノムDNA 1 μgに添加されたHIV-pol遺伝子50コピーから、497 bpフラグメントを増幅した。様々なホットスタート酵素を使用した：QIAGENのHotStarTaq DNA Polymerase（HotStarTaq）、AII社のホットスタート酵素（Hot-start enzyme）、L社のTaq抗体ミックス（Antibody-mediated）、R社のホットスタートではない酵素（No hot start）。矢印は特異的なPCR産物を示す。各PCR反応液から同量を2%アガロースゲルにロードした。M：マーカー。|3種類の異なるプライマー／テンプレートシステムでR社のTaq DNA polymerase（R）、あるいはHotStarTaq DNA Polymerase（H）を用い、同じ条件下でPCRを行なった。システム 1：ヒトゲノムDNAからD-IgIの1.1 kbのフラグメントを増幅した。システム 2：ヒトゲノムDNAからX連鎖性若年性網膜分離症に関与している染色体領域の296 bpのフラグメントを増幅した。システム 3：トータルRNAより合成されたcDNAからβ-アクチンの214 bpのフラグメントを増幅した。M：マーカー。|ヒトインターロイキン1レセプター（タイプ II）遺伝子の1.1 kbフラグメントをcDNAから増幅した。増幅反応は以下の組み合わせで3セット調製した： L社のTaq DNA polymeraseとバッファー（No hot start）； L社の抗体修飾した酵素とバッファー（Antibody-mediated）；QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer（HotStarTaq）。M：マーカー。|フローサイトメトリーを用いて直接各PCRチューブに分離した1個の細胞からマウスp53 遺伝子の500 bp フラグメントを増幅した。各反応は以下の組み合わせで行なった：QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer（HotStarTaq）、AII社のホットスタート酵素とバッファー（Hot-start enzyme）、L社の抗体修飾した酵素とバッファー（抗体利用）。M：マーカー。|表記のMg2+濃度で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA Polymerase（QIAGEN）を用いてPCR反応を行なった。同じ条件のPCR反応をAII社のPCRバッファーとTaq DNA polymerase を用いて行なった。QIAGENのバッファーと酵素を使用した各実験ではシングルコピーのヒトプリオンタンパク遺伝子が良好に増幅された。M：マーカー。|マウスのp53遺伝子フラグメントをゲノムDNAからマルチプレックスPCRで増幅した。R社の酵素（No hot start）および QIAGEN のHotStarTaq Master Mix Kit（HotStarTaq Master Mix）を用いて、スタンダードの条件で増幅反応を同時に行なった。M：マーカー。|QIAGEN PCR Buffer中のアンモニウムイオンとカリウムイオンにより、プライマーのアニーリングにおける特異性が増加。K+ はDNA バックボーンのリン酸基（P–）に結合し、テンプレートへのプライマーアニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基（B）間の水素結合に相互作用するため、ミスマッチの塩基間の水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマー／テンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。|
パフォーマンス

HotStarTaq Master Mix Kitは全てのロットで、低コピー数のターゲットを増幅する実験によりPCR特異性の厳密さや再現性をチェックするなど、広範囲の品質管理テストを受けています。HotStarTaq Master Mix Kitは他社のキットに比べて高性能で、特異性と感度の高いホットスタートPCRを実現します（図"Higher specificity with different primer–template systems異なるプライマー／テンプレートシステムにおける高特異性"、"卓越した性能 " および表）。キットに付属の画期的なPCRバッファーは、様々なPCR条件において特異性を実現し、至適化は最小限に抑えられます（図 "幅広い至適アニーリング温度" および"異なったマグネシウム濃度への適応"）。

高い特異性と簡便な操作を実現するHotStarTaq Master Mix Kitは、複雑なゲノムテンプレートあるいはcDNAテンプレート（図“RT-PCR性能へのホットスタートの影響”）、複数のプライマーペア（図“Multiplex PCRにおける特異的な増幅”）、増幅困難なサンプルあるいは低コピーのターゲット（図“高感度のシングルセルPCR”）などとの使用に適しています。これはまた、遺伝子スクリーニングのような多数サンプルを増幅するプロジェクトに最適です。

ホットスタート法の比較 
HotStarTaq DNA Polymerase ホットスタート酵素AII社 抗体利用 マニュアル ワックスバリア
特異的な増幅 ++ + + +/– +/–
PCR至適化の不要性 ++ +/– +/– – –
取り扱いの簡便さ ++ ++ + – –
HotStarTaq DNA Polymerase 詳細データ

濃度：5 units/µl
組み換え酵素：Yes
基質アナログ：dNTP、ddNTP、dUTP、biotin-11-dUTP、DIG-11-dUTP、 fluorescent-dNTP/ddNTP
エクステンション速度：72℃ で2～4 kb/min　
半減期：97℃で10分、94℃で60分　
増幅効率：≥105 倍
5'–>3' エキソヌクレアーゼ活性：Yes
余分なA付加：Yes
3'–>5' エキソヌクレアーゼ活性：No
ヌクレアーゼの混入：No
RNasesの混入：No
プロテアーゼの混入：No
自己プライマー活性：No 

原理

HotStarTaq Master Mixは即使用可能なマスターミックスで、HotStarTaq DNA Polymerase、QIAGEN PCR Buffer、dNTPsが入っています。Taq DNA Polymeraseを修飾したHotStarTaq DNA PolymeraseはホットスタートPCR において高い特異性を実現します。

HotStarTaq DNA Polymerase

HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により、PCR セットアップや最初のPCR サイクル中の低温での非特異的なプライマーのアニーリングやプライマーダイマーの形成を回避できます（図"ホットスタートPCRで最高のパフォーマンスを実現"および"異なるプライマー／テンプレートシステムにおける高特異性"）。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。

QIAGEN PCR Buffer

QIAGEN PCR Buffer は、各PCRサイクルでアニーリングステップ中にプライマー特異的な結合の割合を非特異的な結合に対して高めることにより、各PCRサイクルの特異的な増幅を維持します（図“プライマーのアニーリングの特異性増大”）。このバッファーはユニークな配合比のKClと (NH4)2SO4を含み、従来のPCRバッファーに比べ、幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密で特異的なプライマーアニーリングを実現します。従って、異なるアニーリング温度あるいはMg2+濃度を用いて行なうPCRの至適化は最小限ですみ、または不要なこともあります（図 "幅広い至適アニーリング温度"および"異なったマグネシウム濃度への適応"）。

操作手順
HotStarTaq Master Mix Kitは簡便なマスターミックスフォーマットですので、操作は容易です。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。マスターミックスを用いて、反応セットアップを室温で迅速かつ容易に行なえます。 25 µlのHotStarTaq Master Mixを各PCRチューブにピペットでいれ、RNaseフリー水（キットに付属）で希釈したプライマーとテンプレートDNAを25 µl添加します（図"HotStarTaq操作手順"）。ピペッティングステップは最小限に抑えられ、エラーとコンタミのリスクが減少し、スループット数と再現性が増加します。キットに付属の至適化済みのプロトコールにより、PCRセットアップを迅速かつ容易に行なえます。
アプリケーション

HotStarTaq Master Mix Kitは、増幅などの高度なアプリケーションを含む様々なアプリケーションに最適です： 

  • 複雑なゲノムテンプレート
  • 複雑なcDNAテンプレート（例；RT-PCR）
  • 低コピーのターゲット（例；シングルセルPCR）
  • マルチプレックスPCR
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Feature
Specifications
Applications PCR, RT-PCR, Complex genomic templates, very low-copy targets
Enzyme activity 5'-> 3' exonuclease activity
Mastermix Yes
Reaction type PCR amplification
Real-time or endpoint Endpoint
Sample/target type Genomic DNA and cDNA
Single or multiplex Single
With/without hotstart With hotstart

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キットハンドブック
1
HotStarTaq PCR Handbook - (EN)
HotStarTaq DNA Polymerase; HotStarTaq Master Mix Kit - For highly specific hot-start PCR without optimization  
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クイックスタートプロトコール
1
HotStarTaq Master Mix Kit (EN)

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User-Developed Protocols
1
Isolation of bacterial DNA from soil using the QIAamp® DNA Stool Mini Kit and QIAamp DNA Blood Midi Kit - (EN)
As starting material, 5 g soil was mixed with different amounts of Bacillus subtilis cells. Sensitivity was 5 x 103 cells/5g soil.
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MSDS
1
Safety Data Sheets
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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画像
Highly specific PCR results with both manual and automated PCR setup
HotStarTaq操作手順

HotStarTaq操作は迅速かつ容易で最高の使いやすさを実現する。

Superior Performance in Hot-Start PCR
卓越した性能
ヒトゲノムDNA 1 μgに添加されたHIV-pol遺伝子50コピーから、497 bpフラグメントを増幅した。様々なホットスタート酵素を使用した：QIAGENのHotStarTaq DNA Polymerase（HotStarTaq）、AII社のホットスタート酵素（Hot-start enzyme）、L社のTaq抗体ミックス（Antibody-mediated）、R社のホットスタートではない酵素（No hot start）。矢印は特異的なPCR産物を示す。各PCR反応液から同量を2%アガロースゲルにロードした。M：マーカー。
Higher Specificity with Different Primer–Template Systems
異なるプライマー／テンプレートシステムにおける高特異性
3種類の異なるプライマー／テンプレートシステムでR社のTaq DNA polymerase（R）、あるいはHotStarTaq DNA Polymerase（H）を用い、同じ条件下でPCRを行なった。システム 1：ヒトゲノムDNAからD-IgIの1.1 kbのフラグメントを増幅した。システム 2：ヒトゲノムDNAからX連鎖性若年性網膜分離症に関与している染色体領域の296 bpのフラグメントを増幅した。システム 3：トータルRNAより合成されたcDNAからβ-アクチンの214 bpのフラグメントを増幅した。M：マーカー。
Effect of Hot Start on RT-PCR Performance
RT-PCR性能へのホットスタートの影響
ヒトインターロイキン1レセプター（タイプ II）遺伝子の1.1 kbフラグメントをcDNAから増幅した。増幅反応は以下の組み合わせで3セット調製した： L社のTaq DNA polymeraseとバッファー（No hot start）； L社の抗体修飾した酵素とバッファー（Antibody-mediated）；QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer（HotStarTaq）。M：マーカー。
Single-Cell PCR
高感度のシングルセルPCR
フローサイトメトリーを用いて直接各PCRチューブに分離した1個の細胞からマウスp53 遺伝子の500 bp フラグメントを増幅した。各反応は以下の組み合わせで行なった：QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer（HotStarTaq）、AII社のホットスタート酵素とバッファー（Hot-start enzyme）、L社の抗体修飾した酵素とバッファー（抗体利用）。M：マーカー。
Wide Annealing-Temperature Window
異なったマグネシウム濃度への適応
表記のMg2+濃度で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA Polymerase（QIAGEN）を用いてPCR反応を行なった。同じ条件のPCR反応をAII社のPCRバッファーとTaq DNA polymerase を用いて行なった。QIAGENのバッファーと酵素を使用した各実験ではシングルコピーのヒトプリオンタンパク遺伝子が良好に増幅された。M：マーカー。
Specific Amplification in Multiplex PCR
Multiplex PCRにおける特異的な増幅
マウスのp53遺伝子フラグメントをゲノムDNAからマルチプレックスPCRで増幅した。R社の酵素（No hot start）および QIAGEN のHotStarTaq Master Mix Kit（HotStarTaq Master Mix）を用いて、スタンダードの条件で増幅反応を同時に行なった。M：マーカー。
NH4+ and K+ cations in QIAGEN PCR buffers increase specific primer annealing
プライマーアニーリングの特異性増大
QIAGEN PCR Buffer中のアンモニウムイオンとカリウムイオンにより、プライマーのアニーリングにおける特異性が増加。K+ はDNA バックボーンのリン酸基（P–）に結合し、テンプレートへのプライマーアニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基（B）間の水素結合に相互作用するため、ミスマッチの塩基間の水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマー／テンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。