HotStarTaq DNA Polymerase

最小限の至適化で特異性の高い増幅反応
  • 最小限の至適化
  • 高いPCR特異性
  • 取り扱いが簡単、室温でのセットアップが可能

HotStarTaq DNA Polymerase は抗体によるホットスタートシステムではなく、化学修飾によるホットスタートを利用しているため、最初の熱活性化ステップまではポリメラーゼ活性は全くありません。HotStarTaq DNA Polymerase には、非特異的な増幅産物、プライマーダイマー、バックグラウンドを最小限に抑える画期的なQIAGEN PCR Buffer が入っています。また増幅困難なテンプレート(例;GC リッチ)の効率的な増幅を実現するQ-Solutionも含まれています。

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HotStarTaq DNA Polymerase (250 U)
250 units HotStarTaq DNA Polymerase, 10x PCR Buffer, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2
203203
¥23,000
HotStarTaq DNA Polymerase (1000 U)
4 x 250 units HotStarTaq DNA Polymerase, 10x PCR Buffer, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2
203205
¥83,000
HotStarTaq DNA Polymerase (5000 U)
1 x 5000 units HotStarTaq DNA Polymerase, 1 x HotStarTaq Buffer Set (1 x 22 ml PCR Buffer, 1 x 40 ml Q-Solution, 1 x 22 ml MgCl2)
203207
¥350,000
HotStarTaq DNA Polymerase (25000)
100 x 250 units HotStarTaq DNA Polymerase, 100 x 1.2 ml HotStarTaq Buffer Set, 100 x 2.0 ml Q-Solution, 100 x 1.2 ml MgCl2
203209
¥1,400,000

HotStarTaq DNA Polymerase  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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HotStarTaq操作手順|卓越した性能|増幅困難なテンプレートの増幅|異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性|RT-PCR におけるホットスタートの効果|高感度のシングルセルPCR|異なったマグネシウム濃度への適応|プライマーアニーリングの特異性増大|
HotStarTaq操作手順は迅速かつ容易で最高の使いやすさを実現する。|ヒトゲノムDNA 1 μgに添加されたHIV-pol遺伝子50コピーから、497 bpフラグメントを増幅した。様々なホットスタート酵素を用いた:QIAGENのHotStarTaq DNA Polymerase(HotStarTaq)、AII社のホットスタート酵素(Hot-start enzyme))、L社のTaq 抗体ミックス(Antibody-mediated)、R社のホットスタートではない酵素(No hot start)。矢印は特異的なPCR産物を示す。各PCR反応液から同量を2%アガロースゲルにロードした。M:マーカー。|2種類のプライマー/テンプレートシステムにおいて、1x Q-Solutionの非存在下()あるいは存在下(+)で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA DNA Polymeraseを用いてduplicateで増幅した。Q-Solutionは増幅困難なテンプレートの特異性の高い増幅を実現する。[A] ヒトアンジオテンシンレセプターII遺伝子;[B]  マウスプロテインキナーゼC遺伝子、M:マーカー。|3種類の異なるプライマー/テンプレートシステムでR社のTaq DNA polymerase(R)、あるいはHotStarTaq DNA Polymerase(H)を用い、同じ条件下でPCRを行なった。システム 1:ヒトゲノムDNAからD-IgIの1.1 kbのフラグメントを増幅した。システム 2:ヒトゲノムDNAからX連鎖性若年性網膜分離症に関与している領域の296 bpのフラグメントを増幅した。システム 3:トータルRNAより合成されたcDNAからβ-Actinの214 bpのフラグメントを増幅した。M:マーカー。|ヒト・インターロイキン1レセプター(タイプII)遺伝子の1.1kbフラグメントをcDNAから増幅した。増幅反応は以下の組み合わせで3セット調製した。 L社のTaq DNA polymeraseとバッファー(No hot start); L社の抗体修飾した酵素とバッファー(Antibody-mediated); QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer(HotStarTaq)。M:マーカー.|フローサイトメトリーを用いて直接各PCRチューブに分離した1個の細胞からマウスp53 遺伝子の500 bp フラグメントを増幅した。各反応は以下の組み合わせで行なった:QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer(HotStarTaq)、AII社のホットスタート酵素とバッファー(Hot-start enzyme)、L社の抗体修飾した酵素とバッファ(Antibody-mediated)。M:マーカー。|表記のMg2+濃度で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA Polymerase(QIAGEN)を用いてPCR反応を行なった。同じ条件のPCR反応をAII社のPCRバッファーとTaq DNA polymerase を用いて行なった。QIAGENの酵素およびバッファーを使った場合にはシングルコピーのヒトプリオンタンパク遺伝子が良好に増幅された。M:マーカー。|QIAGEN PCR Buffer中のアンモニウムイオンとカリウムイオンにより、プライマーのアニーリングにおける特異性が増加。K+ はDNA バックボーンのリン酸基(P)に結合し、テンプレートへのプライマー·アニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基(B)間の水素結合に相互作用するため、ミスマッチの塩基間の水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマー·テンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。|
パフォーマンス

HotStarTaq DNA Polymeraseは全てのロットで、低コピー数のターゲットを増幅する実験によりPCR特異性の厳密さや再現性をチェックするなど、広範囲の品質管理テストを受けています。HotStarTaq DNA Polymeraseは他社のキットに比べて高性能で、特異性と感度の高いホットスタートPCRを実現します (図“異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性”、“卓越した性能”および表)。キットに付属の画期的なPCRバッファーは、様々なPCR条件において特異性を実現し、至適化は最小限に抑えられます(図 “幅広い至適アニーリング温度” および“異なったマグネシウム濃度への適応”)。また、キットに付属のQ - Solutionにより、不適切なPCR条件を改善することができます(図 “増幅困難なテンプレートの増幅”)。これらの成分により様々なアプリケーションで特異的な増幅を実現します(図 “RT-PCRにおけるホットスタートの効果”および “高感度のシングルセルPCR”)。

ホットスタート法の比較 
HotStarTaq DNA Polymerase ホットスタート酵素AII 抗体利用 マニュアル ワックスバリア
特異的な増幅 ++ + + +/– +/–
PCR至適化の不要性 ++ +/– +/–
取り扱いの簡便さ ++ ++ +
HotStarTaq DNA Polymerase 詳細データ

濃度:5 units/µl
組み換え酵素:Yes
基質アナログ:dNTP、ddNTP、dUTP、biotin-11-dUTP、DIG-11-dUTP、 fluorescent-dNTP/ddNTP
エクステンション速度:72℃ で2~4 kb/min 
半減期:97℃で10分、94℃で60分 
増幅効率:≥105
5'–>3' エキソヌクレアーゼ活性:Yes
余分なA付加:Yes
3'–>5' エキソヌクレアーゼ活性:No
ヌクレアーゼの混入:No
RNasesの混入:No
プロテアーゼの混入:No
自己プライマー活性:No 

  

原理

Taq DNA Polymeraseを修飾したHotStarTaq DNA Polymeraseは、ホットスタートPCR において高い特異性を実現します。本キットには、2種類の陽イオンを含む画期的なPCRバッファー、Q-Solution、MgCl2が入っています。

HotStarTaq DNA Polymerase

HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により、PCR セットアップや最初のPCR サイクル中の低温での非特異的なプライマーのアニーリングやプライマーダイマーの形成を回避できます(図“ホットスタートPCRで最高のパフォーマンスを実現”および“異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性”)。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、5 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。

QIAGEN PCR Buffer

QIAGEN PCR Buffer は、各PCRサイクルでアニーリングステップ中にプライマー特異的な結合の割合を非特異的な結合に対して高めることにより、各PCRサイクルの特異的な増幅を維持します(図“プライマーアニーリングの特異性増大”)。このバッファーはユニークな配合比のKClと (NH4)2SO4を含み、従来のPCRバッファーに比べ、幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密で特異的なプライマーアニーリングを実現します。従って、異なるアニーリング温度あるいはMg2+ 濃度を用いて行なうPCRの至適化は最小限ですみ、または不要なこともあります(図“幅広い至適アニーリング温度”および“異なったマグネシウム濃度への適応”)。 

Q-Solution

HotStarTaq DNA Polymeraseに入っているQ-Solutionは、DNAの融解を変更することにより増幅困難なテンプレートの増幅を促進する革新的なPCR添加物です。このユニークな試薬により、高度な二次構造をもつテンプレートやGC リッチなテンプレートなどにより生じる不適切なPCR 条件が改善されることがあります(図“増幅困難なテンプレートの増幅”)。DMSOのような汎用されているPCR添加物と異なり、Q-Solutionは一定の濃度で作用し、毒性もなく、PCR純度は保証されています。Q-Solution の添加により、PCR のフィデリティは損なわれません。

操作手順
HotStarTaq DNA Polymeraseに付属の至適化済みプロトコールを用いてPCRセットアップを迅速かつ容易に行なえます。HotStarTaq DNA Polymeraseは、95℃、15 分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。反応は室温で設定することができるので、使いやすく便利です(図"HotStarTaq procedure")。
アプリケーション

HotStarTaq DNA Polymeraseは、増幅などの高度なアプリケーションを含む様々なアプリケーションに最適です:

  • 複雑なゲノムテンプレート
  • 複雑なcDNAテンプレート(例;RT-PCR)
  • 低コピーのターゲット(例;シングルセルPCR)
  • マルチプレックスPCR
Feature
Specifications
Applications PCR, RT-PCR, Complex genomic templates, very low-copy targets
Enzyme activity 5' -> 3' exonuclease activity
Mastermix No
Reaction type PCR amplification
Real-time or endpoint Endpoint
Sample/target type Genomic DNA and cDNA
Single or multiplex Single
With/without hotstart With hotstart

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FAQ
19
FAQ ID -74
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FAQ ID -75
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FAQ ID -87
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FAQ ID -165
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FAQ ID -1745
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FAQ ID -204
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FAQ ID -288
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FAQ ID -961
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キットハンドブック
1
HotStarTaq DNA Polymerase; HotStarTaq Master Mix Kit - For highly specific hot-start PCR without optimization  
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Supplementary Protocols
2

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マイクロダイセクションにより採取した組織サンプルからのDNA分離およびHotStarTaq DNA Polymeraseを用いた増幅
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クイックスタートプロトコール
1
References
0
画像
Highly specific PCR results with both manual and automated PCR setup
HotStarTaq操作手順

HotStarTaq操作手順は迅速かつ容易で最高の使いやすさを実現する。

Superior Performance in Hot-Start PCR
卓越した性能
ヒトゲノムDNA 1 μgに添加されたHIV-pol遺伝子50コピーから、497 bpフラグメントを増幅した。様々なホットスタート酵素を用いた:QIAGENのHotStarTaq DNA Polymerase(HotStarTaq)、AII社のホットスタート酵素(Hot-start enzyme))、L社のTaq 抗体ミックス(Antibody-mediated)、R社のホットスタートではない酵素(No hot start)。矢印は特異的なPCR産物を示す。各PCR反応液から同量を2%アガロースゲルにロードした。M:マーカー。
Amplification of Difficult Templates with Q-Solution
増幅困難なテンプレートの増幅
2種類のプライマー/テンプレートシステムにおいて、1x Q-Solutionの非存在下()あるいは存在下(+)で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA DNA Polymeraseを用いてduplicateで増幅した。Q-Solutionは増幅困難なテンプレートの特異性の高い増幅を実現する。[A] ヒトアンジオテンシンレセプターII遺伝子;[B]  マウスプロテインキナーゼC遺伝子、M:マーカー。
Higher Specificity with Different Primer–Template Systems
異なるプライマー/テンプレートシステムにおける高特異性
3種類の異なるプライマー/テンプレートシステムでR社のTaq DNA polymerase(R)、あるいはHotStarTaq DNA Polymerase(H)を用い、同じ条件下でPCRを行なった。システム 1:ヒトゲノムDNAからD-IgIの1.1 kbのフラグメントを増幅した。システム 2:ヒトゲノムDNAからX連鎖性若年性網膜分離症に関与している領域の296 bpのフラグメントを増幅した。システム 3:トータルRNAより合成されたcDNAからβ-Actinの214 bpのフラグメントを増幅した。M:マーカー。
Effect of Hot Start on RT-PCR Performance
RT-PCR におけるホットスタートの効果
ヒト・インターロイキン1レセプター(タイプII)遺伝子の1.1kbフラグメントをcDNAから増幅した。増幅反応は以下の組み合わせで3セット調製した。 L社のTaq DNA polymeraseとバッファー(No hot start); L社の抗体修飾した酵素とバッファー(Antibody-mediated); QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer(HotStarTaq)。M:マーカー.
Single-Cell PCR
高感度のシングルセルPCR
フローサイトメトリーを用いて直接各PCRチューブに分離した1個の細胞からマウスp53 遺伝子の500 bp フラグメントを増幅した。各反応は以下の組み合わせで行なった:QIAGENのHotStarTaq DNA PolymeraseとPCR Buffer(HotStarTaq)、AII社のホットスタート酵素とバッファー(Hot-start enzyme)、L社の抗体修飾した酵素とバッファ(Antibody-mediated)。M:マーカー。
Wide Annealing-Temperature Window
異なったマグネシウム濃度への適応
表記のMg2+濃度で、QIAGEN PCR BufferとTaq DNA Polymerase(QIAGEN)を用いてPCR反応を行なった。同じ条件のPCR反応をAII社のPCRバッファーとTaq DNA polymerase を用いて行なった。QIAGENの酵素およびバッファーを使った場合にはシングルコピーのヒトプリオンタンパク遺伝子が良好に増幅された。M:マーカー。
NH4+ and K+ cations in QIAGEN PCR buffers increase specific primer annealing
プライマーアニーリングの特異性増大
QIAGEN PCR Buffer中のアンモニウムイオンとカリウムイオンにより、プライマーのアニーリングにおける特異性が増加。K+ はDNA バックボーンのリン酸基(P)に結合し、テンプレートへのプライマー·アニーリングを安定化する。サーマルサイクリング条件下では、アンモニウムイオンおよびアンモニアの両方として存在するNH4+は、塩基(B)間の水素結合に相互作用するため、ミスマッチの塩基間の水素結合を不安定にする。これら2 種類の陽イオンの組み合わせ効果により、幅広い温度範囲において非特異的なプライマー·テンプレート結合に対して特異的な結合の比率が高く保たれる。