EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kits

96ウェルフォーマットでの様々なスタートサンプルからの超高速で効率的なBisulfite変換
  • 至適化済みの操作で99%以上の高いシトシン変換率
  • わずか30分で効率的なBisulfite変換
  • ゲノムDNA、全血、細胞、組織、FFPE切片用に特化されたソリューション
  • DNAのハイスループットな変換と精製を実現する96ウェルプレートフォーマット
  • DNA分解を回避する画期的なDNA Protectテクノロジー
EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsは、様々なスタートサンプルに対応する高い柔軟性を提供する一方、わずか30分で非メチル化シトシンをウラシルに高い効率で変換する統合的なシステムです。サンプル溶解並びに全血/培養細胞/組織サンプル/ゲノムDNA/FFPE組織切片由来のDNAを直接Bisulfite処理する能率的な手法により、効率的なBisulfite変換を迅速かつ簡単に行なえます。革新的なDNA Protectテクノロジーは分解のない効率的なDNA変性を実現するため、高いDNA収量と再現性のある結果が得られます。この96ウェルでの操作手順は、遠心装置または吸引マニフォールドを用いて処理することができ、超高速でハイスループットなBisulfite変換を実現します。
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EpiTect Fast 96 Bisulfite Kit
2 x EpiTect 96-well Plates, Bisulfite Solution, DNA Protect Buffer, Carrier RNA, Buffers
59720
¥142,000
EpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kit
Deparaffinization Solution, Lysis Buffer, Proteinase K, 2 x EpiTect 96-well Plates, Bisulfite Solution, DNA Protect Buffer, Carrier RNA, Buffers
59740
¥242,000

EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kits は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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X染色体DNAの高効率シトシン変換|EpiTect Fast 96 DNA Bisufite Kit 操作手順|EpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kit操作手順|EpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kit操作手順|Bisulfite変換後のDNAフラグメントサイズの分析|卓越したBisulfite変換|DNA Protect Buffer|EpiTect Fast 96 Bisufite Conversion Kit|EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kits.の相互関係|
EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いてK562ゲノムDNAのBisulfite変換を行ない、X染色体から100 bpの増幅産物をシトシンフリーのプライマーで増幅し、未変換およびBisulfite変換DNAの増幅を行なった。PCR産物をベクターにクローニングし、Sangerシークエンシング法を用いて変換したシトシンを同定した。1252個の個々のシトシンを解析し、シトシン変換効率が99.8%であった。この高い変換効率は、このゲノムDNAが女性由来であるため特に意義がある;すなわち2つのX染色体の一つが高度にメチル化されている。|EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite KitはゲノムDNAの完全なBisulfite変換とクリーンアップを効率的かつ簡単に約1時間で実現|脱パラフィン、溶解、クロスリンク切断ステップの完了後、EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitを用いてBisulfite変換|サンプル溶解ステップの完了後、添付のEpiTect Fast 96 DNA Bisulfite KitでBisulfite変換を実施|EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いたBisulfite変換後、1 µgのゲノムDNAの断片化レベルは最も低く、フラグメントサイズの分布は数百bpから6 kbを超える範囲であったが、他社のキットでは500 bpと1 kbにそれぞれピークがあった。サンプルはAgilent RNA 6000 Nano Chipで解析した。|ゲノムDNAとBisulfite変換DNAを一緒に増幅し、その後パイロシークエンシングにより個々のシトシンの変換率を定量した。[A] 2 µgのDNAを解析した場合、EpiTect Fast DNA Bisulfite KitはZ社のキットと同等の結果であった。[B] しかし、解析されたDNAが微量である場合(10 ng)、このパイログラムに示されている4つのシトシン残基は、Z社のキットよりもEpiTect Fast DNA Bisulfite Kitが卓越した結果であることを証明している(Bisulfite変換されなかった各シトシン残基の割合をZ社のキット対EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitで比較:それぞれ12%対2%、5%対1%、37%対9%、11%対2%)。|DNA Protect BufferをBisulfite変換反応液に添加すると、バッファーの色が緑色から青色に変わることで溶液が十分に混和され、適切なpH値であることが示される。||サンプルタイプに応じてDNAのBisulfite変換は特化されたキットとプロトコールが必要。キットにはDNA抽出に至適化済みのバッファーとDNAのBisulfite変換に必要な全試薬が含まれている。|
パフォーマンス
効率の高いBisulfite変換

反応効率がダウンストリーム解析の信頼性に非常に大きな影響を与えることから、DNAのBisulfite処理および非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、メチル化解析において最も重要なステップです。EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kitsに入っている革新的なBisulfite Solutionにより、2本のX染色体の1本が高度にメチル化された女性サンプルに由来するX染色体のゲノムDNAのような非常に分析困難なサンプルでも超高速で効率良くBisulfite変換が行なえます(図"X染色体DNAの高効率シトシン変換")。パイロシークエンシングを用いた個々のシトシン変換の定量では、スタートサンプル量が少ない場合は特に、他社のキットに比べてEpiTect Fast Bisulfite Conversion Kitがより効果的に変換したことが示されています(図 "Superior bisulfite conversion")。

DNA断片化を低減

完全なBisulfite変換に必要な過酷な条件は、高度なDNA断片化やサンプル消失を引き起こすため、DNA収量の低下、DNAの激しい断片化、再現性のない変換効率につながります。QIAGENのユニークなDNA Protect BufferはDNA分解を抑えるため、他社のキットで変換したDNAよりも大きいサイズのフラグメントで完全に変換されたDNAが得られます(図 "Bisulfite変換後のDNAフラグメントサイズの分析")。

原理

DNAサンプルの迅速かつ完全なBisulfite変換は、正確なDNAメチル化解析のために不可欠です。EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsには、わずか30分で高効率にBisulfite変換を可能にする革新的なBisulfite Solutionが入っています。サンプルの溶解および変換のための迅速なプロトコールは、効率的なDNAのBisulfite変換および精製を可能にする一方、Bisulfite処理中に生じるDNA断片化を最小限に抑えます。3種類のEpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsを組み合わせることにより、様々なスタートサンプルのDNAを直接Bisulfite処理できます(図 "EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsの相互関係")。しかし各キットは単独のキットとしても機能し、特定のサンプルタイプに対応するための必要なバッファーと試薬類が全て含まれています。各キットの成分は効率的なサンプル溶解、溶解中のDNA消失の回避、完全なBisulfite変換、変換中のDNA保護および徹底的なDNAクリーンアップを実現します。

迅速なBisulfite変換

EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsは、ゲノムDNA/FFPE/血液/細胞/組織サンプルから調製したDNAの変換と精製を効率的に行なうための非常に迅速で能率的な操作を実現します。 本キットに入っている濃縮されたBisulfite Solutionは、非メチル化シトシンからウラシルへの変換に必要な時間を数時間からわずか30分に短縮し、また調製用バッファーによりBisulfite処理前のDNA単離は必要ありません。さらにBisulfiteサーマルサイクリングプログラムは、DNAの熱変性および続いて行なうスルホン化とシトシン脱アミノ化のために必要なインキュベーションステップがすべて最適化されているため、99%以上の高いシトシンの変換率を可能にします。シトシンの化学的な変換における最終工程である脱スルホン化は、精製工程に含まれる簡便なステップによって実施されます。

DNA Protect Buffer

サンプルDNAの迅速で完全なBisulfite変換は、メチル化パターンの正確な決定に最も重要なステップです。これはDNAを高濃度のBisulfite塩中で高温かつ低いpHでインキュベートすることにより実現できます。これらの過酷な条件は、激しいDNAの断片化や精製中のサンプル消失を引き起こすことがよくあります。一般的なBisulfite処理法は、変換中のDNA分解や精製中のDNA消失を補うために高濃度のインプットDNAを必要としますが、低いDNA収量や高度に断片化されたDNA、また再現不可能な変換率という結果につながることが多々あります。EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsを用いると、Bisulfite変換中のDNA断片化がユニークなDNA Protect Bufferにより回避できます。本バッファーは、高温かつ低いpH値でのBisulfite処理により通常発生するDNA断片化を保護するために独自の配合成分で調製されています。 また、効率的なDNA変性を実現し、その結果完全なシトシン変換に必要な一本鎖DNAが得られます。DNA Protect Bufferには便利なpH指示薬も含まれているため、反応液を混和した際に完全にシトシンを変換するための正確なpH値を色調で確認できます(図 "DNA Protect Buffer")。

FFPEサンプルの脱パラフィン

FFPEサンプルからDNAを抽出するための最初のステップはパラフィンを溶解・除去する脱パラフィンステップで、次に溶解バッファーとProteinase Kによりサンプルを処理します。EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kitを用いると、最小限の操作で脱パラフィンを促進する画期的なケミストリーであるDeparaffinization Solutionが、FFPE切片の脱パラフィン、溶解、クロスリンク切断を最適化します。Deparaffinization Solutionはサンプル上に留まり、Proteinase Kによる分解を同時に行なうため、高いDNA回収率が得られます。FFPEサンプルをペレット化したりパラフィンを含む上清を除去する必要がないため、脱パラフィン中のサンプル消失のリスクが回避されます。

操作手順

EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitを用いた操作手順は、いくつかの簡単なステップで構成されています:サンプルからのDNA調製、非メチル化シトシンのBisulfiteによる変換;EpiTect 96 プレートのメンブレンへの変換された一本鎖DNAの結合;洗浄;メンブレンに結合したDNAの脱スルホン化;脱スルホン剤を除去するためにメンブレンに結合したDNAの洗浄;変換された高純度DNAをスピンカラムから溶出。FFPE切片、全血、細胞培養液、組織ではサンプル調製法は異なりますが、抽出したDNAのBisulfite変換はすべての種類のサンプルで同一です(図 "EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitsの相互関係")。DNAスタートサンプル量に関わらず、すべてのプロトコールで同じシトシン変換率を達成し、変換したDNAの精製後に等量のDNAが回収できます。

製品概要

EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kit

EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitには特別に調製されたバッファーと試薬が入っており、ゲノムDNAのBisulfite変換と続く変換されたDNAのクリーンアップを効率的に行ないます(図 "EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitの操作手順")。斬新なBisulfite Solutionがわずか30分で高効率にBisulfite変換を可能にする一方、DNA ProtectテクノロジーとEpiTect 96プレートは、分解を最小限に抑えてDNAの完全変換を実現し、必要なダウンストリームアプリケーション用にわずか10 µlの溶出バッファーで高濃度なDNAを溶出できます。EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitを用いると1 ng~2 µg のDNAが変換可能です。

EpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kit

ホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed、paraffin-embedded;FFPE)組織はEpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kitで処理されます。本キットは、FFPE組織切片の脱パラフィンと溶解を効率的に行なうための特殊なバッファーが入ったEpiTect Fast 96 FFPE Lysis Kit(図 "EpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kit操作手順")と、抽出したDNAの迅速で効率的なBisulfite変換のためのEpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitで構成されています。本プロトコールはDNAの結合を促進するために至適化されたステップを含み、シングルのFFPE組織切片(厚さ10 µm)に使用できます。FFPE組織からDNAを抽出する際に必然的に生じるDNA断片化は、続くBisulfite処理の過酷な条件のためにさらに悪化します。QIAGENの信頼できるDNA Protectテクノロジーは変換反応中の断片化を最小限に抑えるため、Bisulfite変換されたDNAが高収量で得られます。

EpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kit

全血、培養細胞、組織サンプルはEpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kitで処理します。本キットは、特殊な溶解バッファーが入ったEpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kit(図 "EpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kit操作手順")と、抽出したDNAをBisulfite変換するためのEpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitで構成されています。本プロトコールには、サンプルからDNAを能率的に遊離するために独自の配合成分を持つ溶解バッファーを用いてDNAの結合を促進するために至適化されたステップが含まれています。本キットで0.5~20 µlの血液あるいは10~105個の細胞を処理できます(最少60 pgのDNA)。

アプリケーション
EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kitは様々なスタートサンプルから迅速で効率的なDNAのBisulfite変換を実施でき、以下のようなDNAメチル化解析に現在使用されているあらゆるテクニックに最適です:
  • PCR:エンドポイント、リアルタイム、メチル化特異的
  • Bisulfiteシークエンシング(直接およびクローニング)
  • COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis)
  • パイロシークエンシング

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キットハンドブック
2
For sample lysis and complete bisulfite conversion/cleanup of DNA from FFPE, blood, cultured cells, or tissue samples, optimized for methylation analysis in a 96-well format
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For sample lysis and complete bisulfite conversion/cleanup of DNA from FFPE, blood, cultured cells, or tissue samples, optimized for methylation analysis
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画像
Highly efficient cytosine conversion of  X-chromosome DNA
X染色体DNAの高効率シトシン変換
EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いてK562ゲノムDNAのBisulfite変換を行ない、X染色体から100 bpの増幅産物をシトシンフリーのプライマーで増幅し、未変換およびBisulfite変換DNAの増幅を行なった。PCR産物をベクターにクローニングし、Sangerシークエンシング法を用いて変換したシトシンを同定した。1252個の個々のシトシンを解析し、シトシン変換効率が99.8%であった。この高い変換効率は、このゲノムDNAが女性由来であるため特に意義がある;すなわち2つのX染色体の一つが高度にメチル化されている。
EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kit procedure
EpiTect Fast 96 DNA Bisufite Kit 操作手順
EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite KitはゲノムDNAの完全なBisulfite変換とクリーンアップを効率的かつ簡単に約1時間で実現
EpiTect Fast FFPE Bisulfite Kit procedure
EpiTect Fast 96 FFPE Bisulfite Kit操作手順
脱パラフィン、溶解、クロスリンク切断ステップの完了後、EpiTect Fast 96 DNA Bisulfite Kitを用いてBisulfite変換
EpiTect Fast  LyseAll Bisulfite Kit procedure
EpiTect Fast 96 LyseAll Bisulfite Kit操作手順
サンプル溶解ステップの完了後、添付のEpiTect Fast 96 DNA Bisulfite KitでBisulfite変換を実施
Analysis of DNA fragment sizes after bisulfite conversion
Bisulfite変換後のDNAフラグメントサイズの分析
EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitを用いたBisulfite変換後、1 µgのゲノムDNAの断片化レベルは最も低く、フラグメントサイズの分布は数百bpから6 kbを超える範囲であったが、他社のキットでは500 bpと1 kbにそれぞれピークがあった。サンプルはAgilent RNA 6000 Nano Chipで解析した。
Superior bisulfite conversion
卓越したBisulfite変換
ゲノムDNAとBisulfite変換DNAを一緒に増幅し、その後パイロシークエンシングにより個々のシトシンの変換率を定量した。[A] 2 µgのDNAを解析した場合、EpiTect Fast DNA Bisulfite KitはZ社のキットと同等の結果であった。[B] しかし、解析されたDNAが微量である場合(10 ng)、このパイログラムに示されている4つのシトシン残基は、Z社のキットよりもEpiTect Fast DNA Bisulfite Kitが卓越した結果であることを証明している(Bisulfite変換されなかった各シトシン残基の割合をZ社のキット対EpiTect Fast DNA Bisulfite Kitで比較:それぞれ12%対2%、5%対1%、37%対9%、11%対2%)。
DNA Protect Buffer
DNA Protect BufferをBisulfite変換反応液に添加すると、バッファーの色が緑色から青色に変わることで溶液が十分に混和され、適切なpH値であることが示される。
EpiTect Fast 96 Bisufite Conversion Kit
Interconnected protocols of the EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits
EpiTect Fast 96 Bisulfite Conversion Kits.の相互関係
サンプルタイプに応じてDNAのBisulfite変換は特化されたキットとプロトコールが必要。キットにはDNA抽出に至適化済みのバッファーとDNAのBisulfite変換に必要な全試薬が含まれている。