メチル化解析用のBisulfiteによるDNAの完全変換およびクリーンアップ
  • 迅速で信頼できる結果を実現する能率的な精製法
  • 完全なシトシン変換
  • ユニークなDNA保護システムにより高感度解析
  • FFPE組織サンプル由来のDNA変換を含む至適化済みプロトコール
  • スピンカラムおよびハイスループット用96ウェルプレートフォーマット

EpiTect Bisulfite Kits は非メチル化シトシンのウラシルへの完全な変換と精製を6時間以内で実現します。EpiTect 96 Bisulfite精製法の所要時間は7時間未満です。高感度なこの方法は革新的な手法によりDNA分解を防ぎ、わずか1 ngのDNAから高感度な結果が得られ、99%以上の非メチル化シトシンを変換します。独特のDNA保護テクノロジーにより、EpiTect Bisulfiteで変換したDNAはEpiTect Whole Bisulfitome Kitsを用いた全ゲノム増幅に最適です。Bisulfite変換したDNAの量が限られる場合でも、信頼性の高いDNA増幅が可能です。EpiTect Bisulfite Kitsにはスピンカラムおよび96ウェルフォーマットがあり、遠心操作あるいは吸引マニホールドを用いて処理できます。さらにEpiTect Bisulfite KitはQIAcube上で完全自動化が可能です。

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製品名 Cat. no. List price:
EpiTect Bisulfite Kit (48)
48 EpiTect Bisulfite Spin Columns, Reaction Mix, DNA Protect Buffer, Carrier RNA, Buffers
59104
¥42,000
EpiTect 96 Bisulfite Kit (2)
2x EpiTect Bisulfite 96-well Plates, Reaction Mix, DNA Protect Buffer, Carrier RNA, Buffers
59110
¥124,000

EpiTect Bisulfite Kits は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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DNAの長期保存|効率の高いシトシン変換|完全なシトシン変換|ユニークなDNA Protect BufferおよびpH指示薬システム。|FFPE組織サンプルからのメチル化解析|EpiTect Bisulfite Conversion 操作手順|簡単で迅速なBisulfite変換|時間を節約する操作手順|エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー|
EpiTect Kitを用いてBisulfite変換したDNAを-20℃で36ヶ月保存し、数ヶ月ごとに増幅した。様々なDNA量に関して全ての時点で得られたthreshold cycle値は、変換直後のDNA(ゼロ時点)で得られた値と同等であった。|EpiTect Bisulfite Kitを用いてシトシンからチミンへの変換率は99.4~99.8%あった。個別に行なった6回のEpiTect Bisulfite反応液(各1 µg DNA)からPCR増幅し、QIAGEN PCR Cloning Kitを用いてクローニングした900以上のクローンを解析した。シークエンス解析した450,000 ntのうち150,000 nt以上が非メチル化シトシンを含んでおり(下の配列)、それらのシトシンはチミンに変換された(上の配列)。(表示した配列は分析した全配列の一部である。)C: 変換DNA、U:未変換DNA。|EpiTect Bisulfite Kitあるいは他社のBisulfiteキット(Supplier E 、Supplier Z)を用いて、メーカーの指示に従って1 µgのゲノムDNAを変換した。続いて、各サンプル同等量中の未変換DNAの存在を以下の方法で測定した。[A] HotStarTaq Plus Master Mix KitによるエンドポイントPCR、[B] QuantiTect SYBR® Green PCR Kitを用いたSYBR® Green によるリアルタイムPCR。EpiTect Bisulfite Kitで処理したDNAは完全に変換されていたが、Supplier EやSupplier Zのキットで処理したDNAにはかなりの量の未変換DNAが含まれていた。|[A] DNA Protect BufferはDNAのBisulfite処理中のDNAの断片化を防ぎ、一本鎖化したDNAの形成を促進することにより、DNAの完全なBisulfite変換を実現する。[B] DNA Protect Bufferに含まれているpH指示薬は、反応液が完全に混合しているかを色調で確認でき、完全にシトシンを変換するための正確なpH値を確保できる。|FFPEサンプルからQIAamp DNA Mini Kitで精製したDNA 1 µgを、EpiTect Bisulfite Kitを用いてFFPEプロトコールに従ってBisulfite変換した。[A] エンドポイントPCRおよび[B] TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRで溶出液40 µlの1 µlを解析した。Glutathione S-Transferase 遺伝子に対するこれらのアッセイは、変換されたDNAで特異的であった。それぞれのアプリケーションで未変換のゲノムDNA(コントロール)は増幅されなかった。||QIAamp DNA Blood Mini Kitを用いて血液からヒトゲノムDNAを精製し、様々な量のDNA(1 ng~1 µg)をEpiTect Bisulfite Kitにより変換した。HotStarTaq Master Mix Kitと変換DNAを増幅するようにデザインしたプライマー2セットを用いてPCRを行なった。各PCR反応液の5 µlを1.3%アガロースゲルにロードした。EpiTect Bisulfite Kit を用いたDNA変換には、わずか1 ngのDNAで十分であった。C:未変換のゲノムDNA(ネガティブコントロール)。M:マーカー。|DNAのBisulfite処理から解析にすぐに使用できる高純度な変換DNAの分離まで、EpiTect Bisulfite Kitによる全工程(遠心法あるいは吸引法)はわずか6時間しかかかりません。従来のBisulfite処理法は18時間以上もかかり、実験に非常に手間取ります。||
パフォーマンス
迅速な結果

DNAのBisulfite処理から解析にすぐに使用できる高純度な変換DNAの分離まで、EpiTect Bisulfite Kitによる全工程(遠心法あるいは吸引法)はわずか6時間しかかかりません。EpiTect 96 Bisulfite精製法の所要時間は7時間未満です。従来のBisulfite処理法は18時間以上もかかり、非常に実験に手間取ります(表"簡単で迅速なBisulfite変換"と図"迅速な操作手順")。EpiTect Bisulfite KitにはBisulfite変換とDNAクリーンアップを成功させるために必要な全てが含まれています。

簡単で迅速なBisulfite変換
EpiTect精製法従来の精製法
試薬のセットアップ10分。分注済みですぐに使用可能40分。試薬のセットアップが必要
Bisulfite反応5時間16時間
精製30~45分。EpiTect Spin Columnおよびプレート120分。精製、脱スルホン化、沈殿、洗浄ステップ
完全なDNA変換

EpiTect Bisulfite Kitを用いた1回の反応で、1 ng~2 µgのDNAを同じ効率で変換できます。斬新な精製法および至適化されたバッファーにより、変換DNAは高い収量で回収できます。変換DNAをリアルタイムPCRで増幅した際に得られたCT値が非常に低いことからシトシンが高効率で変換されたことが明らかです(図"完全なシトシン変換")。EpiTect Bisulfite KitによるDNA変換の解析結果は、非メチル化シトシンが99%以上変換されていることを示しています(図"効率の高いシトシン変換")。この高い変換率は再現性が高く信頼できるダウンストリーム解析を実現します。

原理
微量サンプルのBisulfite変換

最小限のDNAしか得られない貴重なサンプルや限られたサンプル(例:ホルマリン固定パラフィン包埋[FFPE]組織やマイクロダイセクションで採取した組織)中のDNAメチル化パターンを決定することは特に困難です。しかし、疾病を予知する有用なバイオマーカーの同定にはこのようなサンプルタイプは特に重要です。これらのニーズに対応するため、EpiTect Bisulfite Kitにはこのようなサンプルタイプ用に至適化したプロトコールが付いています(図"FFPE組織サンプルからのDNAメチル化解析")。必要なバッファーや試薬は全てキットに入っており、最小限のマニュアルでの作業だけで実験できます。

予めDNAを分離することなくFFPEサンプル、細胞、血液、組織からDNAを直接的にBisulfite変換するためには、EpiTect Plus FFPE Bisulfite KitsおよびEpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kitsの使用をお勧めします。

 DNAの断片化の防止

DNA Protect Bufferは、DNAの断片化を防ぐためのユニークな成分で構成され(通常DNAのBisulfite処理は高温と低いpH値で行なわれる)、効率的にDNAを一本鎖に変性し、その結果DNAを完全にシトシン変換できます(図"ユニークなDNA Protect BufferとpH指示薬システム")。断片化を防ぐことにより、長いPCR増幅産物が得られ解析できます(図"簡単で迅速なBisulfite変換")。さらにDNA Protect BufferにはpH指示薬が含まれているので、シトシン変換のための正確なpHを確認できます。この方法に組み込まれた効率的なDNAクリーンアップにより、DNA品質に影響を及ぼすことなく、変換DNAを少なくとも12ヶ月間保存できます(図"DNAの長期保存")。

操作手順

EpiTect精製法はQIAGENキットの特長である結合、洗浄、溶出システムを利用した簡単な操作工程で構成されている(フローチャート"変換手順")。加熱変性とsodium bisulfite処理によるDNA変換の後、DNAをEpiTect Spin Columnあるいはプレートにアプライし、残留している全てのsodium bisulfiteを除去するため至適化されたバッファーおよび一般的なマイクロ遠心機あるいは吸引マニホールドを用いて洗浄し、その後DNAを溶出する。溶出されたDNAはメチル化に特異的なPCR(Methylation-specific PCR)、リアルタイムPCR解析、Bisulfiteシークエンシング、COBRA、パイロシークエンシングを含む全てのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

エピジェネティクス情報を得ることは生物学や医学研究における多くの分野(特に、腫瘍学や幹細胞研究、および発生生物学)にとって最も重要です。しかし、DNAメチル化における変化の解析はサンプル(特に非常に限られた量のサンプル)から再現性のあるデータを得るための標準化された方法がないために大変な仕事です。QIAGENが新しく紹介するEpiTectソリューションにより、DNAサンプル採取、安定化、精製からBisulfite処理、リアルタイム/エンドポイントPCRメチル化解析またはシークエンシングまで、標準化されたプレアナリティカル用製品および解析用製品を提供いたします。(図"エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー")。

 

アプリケーション

EpiTect Bisulfite Kitを用いて変換、精製したDNAは、以下のような幅広いダウンストリームアプリケーションでの使用に最適です。

メチル化に特異的なPCR(Methylation-specific PCR)、リアルタイムPCR
COBRA 
シークエンシング/パイロシークエンシング/NGS
HRM(High Resolution Melt)
メチル化解析用アレイ
Feature
Specifications
Applications Multiplex PCR, real-time PCR, sequencing
Conversion efficiency 99.4–99.8%
Elution volume Varies
Format Spin column and 96-well plate
Processing Manual (spin and vacuum)
Sample amount 1–2 µg
Sample types Blood, (FFPE) tissue, DNA samples
Time per run or per prep <6 hours (1-48 samples), ~ 7 hours (48-96 samples)
Yield Depends on input amount of purified genomic DNA used for conversion

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FAQ
12
FAQ ID -2002
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FAQ ID -2004
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FAQ ID -2007
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FAQ ID -2009
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FAQ ID -2011
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FAQ ID -2408
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FAQ ID -2409
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FAQ ID -2410
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FAQ - 3343
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FAQ - 3345
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キットハンドブック
3
For complete bisulfite conversion and cleanup of DNA for methylation analysis
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For complete bisulfite conversion and cleanup of DNA for methylation analysis in 96-well format
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メチル化解析のためのbisulfite法による完全なDNA変換およびクリーンアップ用
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