AllPrep DNA/RNA FFPE Kit

ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織切片からゲノムDNA とトータルRNA (small RNAを含む)の同時精製
  • 最小限のサンプルから最大限の結果を実現
  • 品質を損なうことなく DNAとRNA を遊離
  • DNA と RNA を効果的に分離
  • 同一 FFPE サンプルにおいて DNA/RNAを包括的に解析
ゲノムおよび転写産物のデータを正確に比較するためには、同一サンプルからDNAとRNAを精製することが不可欠です。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは特許申請中の溶解法を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片からDNAおよびRNAを精製します。精製された核酸はリアルタイムPCRおよびパイロシークエンスなどのアプリケーションに最適です。
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AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (50)
50 RNeasy MinElute Spin Columns, 50 QIAamp MinElute Spin Columns, Collection Tubes, RNase-Free Reagents, and Buffers
80234
¥74,000

AllPrep DNA/RNA FFPE Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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FFPE サンプルからDNA およびRNA の精製|cDNAターゲットの事前増幅後のアレイ解析|FFPE サンプルからDNA およびRNA の信頼性のある増幅|AllPrep DNA/RNA FFPE操作手順|
[A] 室温で表記期間保存した様々なラットFFPE 組織からゲノムDNA を精製した。AllPrep DNA/RNA FFPE KitあるいはコントロールとしてQIAamp DNA FFPE Tissue Kit(FFPEサンプルからのDNA精製専用キット)を用いて精製し、両キットともにRNase分解ステップを実施した。各サンプルの切片(20 μm)から得たDNA 収量を、A260 の吸光度を測定して計算した。[B] 室温で表記期間保存した様々なラットFFPE 組織からRNA を精製した。AllPrep DNA/RNA FFPE KitあるいはコントロールとしてRNeasy FFPE Kit(FFPEサンプルからのRNA精製専用キット)を用いて精製した。各サンプルの切片(10 μm)から得たRNA 収量を、A260 の吸光度を測定して計算した。AllPrep Kitは、FFPEサンプルからDNA/RNAをそれぞれ分離精製する専用のDNA/RNA精製キットと同様の性能を示した。|AllPrep DNA/RNA FFPE Kitを用いてヒト乳房FFPE組織からトータルRNAを精製した。RT2 FFPE PreAMPテクノロジーを使用してRNAを逆転写し、事前増幅を行なった。リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析は、Human Cell Cycle RT2  Profiler PCR Arrayを用いてリアルタイムPCRによる遺伝子発現を行ない、健常組織とがん組織を比較した。ΔΔCT 解析の結果、健常組織に比較してがん組織の遺伝子発現に数倍の差異が示された。|AllPrep DNA/RNA FFPE Kitと、コントロールとしてFFPEサンプルからのDNAまたはRNA精製専用キット(QIAamp DNA FFPE Tissue KitあるいはRNeasy FFPE Kit)を用いて様々なラットFFPE組織からDNA[A]およびRNA [B]、[C]を精製した。Prnp 遺伝子の増幅産物(78 bp)の解析にはQuantiTect SYBR® Green PCR Kit [A]を、Jun癌遺伝子の発現解析にはQuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit [B]、 [C]を用いてABI PRISM 7900HT Sequence Detection SystemでリアルタイムPCR/RT-PCRを行った。AllPrep Kitによる精製は、専用キットで精製した核酸で得られたCT値と同等であったことから、同等品質の有効なDNAやRNAを効率よく精製できることを示唆している。[C]さらに逆転写酵素なし(-RT)でJun発現解析を行なった。DNAリッチな組織である脾臓サンプルの増幅曲線はゲノムDNAコンタミが実質上ないことを示した。||
パフォーマンス
AllPrep DNA/RNA FFPE Kitを用いて精製したDNAおよびRNAは、QIAamp FFPE Tissue KitおよびRNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPEを用いてそれぞれ精製した DNAおよびRNAに匹敵する品質をもっています(図“FFPE サンプルからDNA およびRNA の精製”)。したがって精製核酸はパイロシークエンス解析あるいはリアルタイムPCR/RT-PCRなどのダウンストリーム・アプリケーションに最適です(図“FFPE サンプルからDNA およびRNA の信頼性のある増幅”および“cDNAターゲットの事前増幅後のアレイ解析”)。
原理

AllPrep DNA/RNA FFPE Kit は、FFPE組織切片からのゲノムDNA とトータルRNAの同時精製用に特別にデザインされています。生体サンプルを分割する必要があるほかの精製法とは異なり、本法ではサンプルを分割せずに高純度DNAおよびRNAが得られます。DNAおよびRNAを別々に精製するためにサンプルを分割すると、性質の異なる可能性のある細胞集団からDNAおよびRNAを精製することになります。また、FFPEサンプルは貴重かつ回収が困難で、量が限られているために、同一サンプルからのDNAおよびRNAの精製はサンプルの浪費を回避することができます。

固定と包埋条件のために、通常FFPEサンプル中の核酸は著しく断片化され、新鮮あるいは凍結したサンプルから得られた核酸よりも分子量が低くなることが頻繁にあります。同一のFFPEサンプルからのDNAおよびRNAを分離する際の大きな問題は、断片化DNAが短く、部分的に一本鎖であり、インタクトなDNAよりもRNAに類似していることです。この断片化DNAの特性のためにDNAおよびRNAの物理的な分離は困難です。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、特許申請中の溶解法により同一FFPEサンプルからDNAとRNAを別々に遊離できます。

またFFPEサンプル中の核酸はホルムアルデヒドにより化学的に修飾されます。ホルムアルデヒドによるクロスリンクはゲル電気泳動やラボオンチップ解析などの通常の品質管理アッセイでは検出されませんが、酵素的な解析を強く阻害します。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、DNAやRNAを分解することなくホルムアルデヒドによるクロスリンクを切断するように最適化されています。

操作手順
同一のFFPE組織切片サンプルから高品質なDNAおよびRNAを簡単な操作手順で精製できます(フローチャート“AllPrep DNA/RNA FFPE 操作手順”)。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、特許申請中の溶解法により同一FFPEサンプルからDNAとRNAを別々に遊離できます。この方法では、FFPEサンプルを至適化済みの溶解バッファーとインキュベートすることで、RNAが遊離しDNAは沈殿します。遠心操作後、RNAを含む上清とDNAを含むペレットは別々の操作により精製されます。さらにインキュベーションにより部分的にクロスリンクは切断され、その後RNeasy MinElute Spin ColumnあるいはQIAamp MinElute Spin Columnを用いてRNAあるいはDNAを精製します。精製RNAに関しては、カラム上でのDNase処理によりコンタミしたDNAを効率的に除去します。RNAの結合条件によって、miRNAなどのsmall RNAを含むRNA、または含まないRNAの精製が可能です。スピンカラム処理を行なう前にDNAとRNAは既に分離されているため、精製されたDNAのRNAコンタミは最小限に抑えられていますが、オプションでカラム上でのRNase処理を行なうこともできます。
アプリケーション

AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、DNAやRNAを分解することなくホルムアルデヒドによるクロスリンクを切断するように最適化されています。 しかしFFPEサンプルから精製した核酸は、高分子のDNAや完全長RNAを必要とするダウンストリームアッセイには推奨されません。いくつかのアプリケーションでは断片化した核酸を使用できるように実験を変更する必要があります(例えばPCRやRT-PCRで短い増幅産物が得られるようにプライマーをデザイン)。cDNA合成にはoligo-dTプライマーの代わりに遺伝子特異的なプライマーの使用を推奨しています。遺伝子特異的なプライマーの使用が不可能な場合は、ランダムプライマーを使用します。

Feature
Specifications
Applications PCR, qPCR, real-time RT-PCR, microarray
Elution volume RNA: 14-30µl ; DNA: 30-100µl
Format Spin column
Main sample type FFPE tissue samples
Number of preps per run 50
Processing Manual (centrifugation)
Purification of total RNA, miRNA, poly A+ mRNA, DNA or protein RNA (miRNA) and DNA
Sample amount max. 4*10 µm sections or 2*20 µm sections
Technology Silica technology
Time per run or per prep 6h for 10 samples, including sectioning
Yield Varies

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パンフレット
3
Critical factors for molecular analysis of FFPE samples
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FFPE サンプルの分子解析における重要なファクター
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High-quality, nucleic acid purification for successful PCR and NGS experiments.
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キットハンドブック
2
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片からのゲノムDNA およびトータルRNA(small RNA を含む)の同時精製
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サイエンティフィック・ポスター
1
安全データシート
1
画像
Purification of DNA and RNA from FFPE samples
FFPE サンプルからDNA およびRNA の精製
[A] 室温で表記期間保存した様々なラットFFPE 組織からゲノムDNA を精製した。AllPrep DNA/RNA FFPE KitあるいはコントロールとしてQIAamp DNA FFPE Tissue Kit(FFPEサンプルからのDNA精製専用キット)を用いて精製し、両キットともにRNase分解ステップを実施した。各サンプルの切片(20 μm)から得たDNA 収量を、A260 の吸光度を測定して計算した。[B] 室温で表記期間保存した様々なラットFFPE 組織からRNA を精製した。AllPrep DNA/RNA FFPE KitあるいはコントロールとしてRNeasy FFPE Kit(FFPEサンプルからのRNA精製専用キット)を用いて精製した。各サンプルの切片(10 μm)から得たRNA 収量を、A260 の吸光度を測定して計算した。AllPrep Kitは、FFPEサンプルからDNA/RNAをそれぞれ分離精製する専用のDNA/RNA精製キットと同様の性能を示した。
Array analysis following preamplification of cDNA targets
cDNAターゲットの事前増幅後のアレイ解析
AllPrep DNA/RNA FFPE Kitを用いてヒト乳房FFPE組織からトータルRNAを精製した。RT2 FFPE PreAMPテクノロジーを使用してRNAを逆転写し、事前増幅を行なった。リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析は、Human Cell Cycle RT2  Profiler PCR Arrayを用いてリアルタイムPCRによる遺伝子発現を行ない、健常組織とがん組織を比較した。ΔΔCT 解析の結果、健常組織に比較してがん組織の遺伝子発現に数倍の差異が示された。
Reliable amplification of DNA and RNA from FFPE samples
FFPE サンプルからDNA およびRNA の信頼性のある増幅
AllPrep DNA/RNA FFPE Kitと、コントロールとしてFFPEサンプルからのDNAまたはRNA精製専用キット(QIAamp DNA FFPE Tissue KitあるいはRNeasy FFPE Kit)を用いて様々なラットFFPE組織からDNA[A]およびRNA [B]、[C]を精製した。Prnp 遺伝子の増幅産物(78 bp)の解析にはQuantiTect SYBR® Green PCR Kit [A]を、Jun癌遺伝子の発現解析にはQuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit [B]、 [C]を用いてABI PRISM 7900HT Sequence Detection SystemでリアルタイムPCR/RT-PCRを行った。AllPrep Kitによる精製は、専用キットで精製した核酸で得られたCT値と同等であったことから、同等品質の有効なDNAやRNAを効率よく精製できることを示唆している。[C]さらに逆転写酵素なし(-RT)でJun発現解析を行なった。DNAリッチな組織である脾臓サンプルの増幅曲線はゲノムDNAコンタミが実質上ないことを示した。
AllPrep DNA/RNA FFPE procedure
AllPrep DNA/RNA FFPE操作手順