微量あるいは貴重なサンプルから全ゲノムを均一に増幅
- 容易な増幅で最高10 µgの一定した収量
- ゲノム遺伝子座のバイアスのない増幅
- Multiple Displacement Amplification(MDA)による信頼できる結果
- 増幅DNAはほとんどのダウンストリームアプリケーションに最適
- 長期保存中にDNA分解のリスクなし
REPLI-g Mini Kit は、画期的なMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーを用いて微量のサンプルから全ゲノム増幅(WGA)に必要な至適化済みの試薬を提供します。50 μlの反応液から得られる典型的なDNA収量は 最高10 μgで、増幅産物の平均的な長さは10 kb以上です(2 kbから100 kbの間)。ユニークなREPLI-gテクノロジーは、精製されたゲノムDNAを含む微量あるいは貴重な各種サンプルから、または新鮮血あるいは乾燥血液、口腔スワブ、新鮮または凍結組織、細胞を直接用いて非常に均一なWGAを提供します。この簡単で信頼性の高い方法は正確でバイアスのないゲノム増幅を行ない、生成されたDNAはさらなる精製操作や定量が不要で、標識が不要なダウンストリームアプリケーション用に使用できます。PCR ベースのWGA テクノロジーとくらべて最高1,000 倍の高いフィデリティを示し、偽陽性や陰性の結果を排除します。WGA テクノロジーについては、弊社ウェブサイトの全ゲノム増幅に関する情報ページをご覧になるか、REPLI-g 製品については表1をご参照ください。
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REPLI g Human Control Kit 25
Human control DNA for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions
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150090
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REPLI-g Mini Kit (25)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 10 µg per reaction)
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150023
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REPLI-g Mini Kit (100)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 100 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 10 µg per reaction)
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150025
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The REPLI-g Mini Kit is intended for molecular biology applications. This product is not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.
Consistent DNA yields using any sample type.|Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.|Consistent long-term stability.|Comparable NGS (next-generation sequencing) results obtained using purified gDNA or REPLI-g amplified DNA.|REPLI-g Mini and Midi procedure.|Accurate genotyping.|Schematic representation of REPLI-g amplification.|Unbiased amplification with Phi29 polymerase.|Highly representative amplification.|Consistent and accurate whole genome amplification.|Uniform DNA yield from various amounts of template.|Reliable SNP genotyping.|
Various starting materials, including genomic DNA, and heparin- and EDTA-preserved whole blood, were amplified using REPLI-g Midi and Mini Kits. Typical yields of 40 µg (Midi Kit) and 8–10 µg (Mini Kit) were obtained.|Genomic DNA samples (10 ng) were denatured using heat (95°C) or the standard REPLI-g Kit alkaline lysis protocol. After amplification using REPLI-g DNA Polymerase, the CT values of 2 loci were compared between samples. The low CT values of loci amplified using the REPLI-g Kit alkaline lysis protocol indicate better locus representation, meaning there has been no loss of sequence information at these loci.|Real-time PCR of REPLI-g amplified DNA samples stored in 4 different formats at –20°C for the indicated time periods. Two loci, [A] locus A and [B] locus B, were assayed for each sample. gDNA: genomic DNA not amplified with REPLI-g. Storage formats: 50 µl REPLI-g reactions: 1) without further manipulation ("50 µl REPLI-g"); 2) aliquoted to 5 µl volumes ("5 µl REPLI-g"); 3) purified with QIAamp Mini Kit ("50 µl QIAamp purified REPLI-g"); and 4) diluted to a concentration of 50 ng/µl (50 µl diluted REPLI-g").|Whole genome sequencing of the Bacillus subtilis genome was performed. For analysis, 2 μg of genomic DNA or DNA amplified from 105 cells using the REPLI-g Midi Kit was sheared into 300 bp fragments. For library preparation, 1 μg of each was used. Sequencing was performed on the Illumina MiSeq instrument. [A] Comparable sequence coverage was observed for both gDNA and REPLI-g amplified DNA. [B] Alignment comparison of the genomic loci sequence demonstrates comparably high percentage of alignment for REPLI-g amplified DNA in comparison to the gDNA, which is an indication of minimized levels of junk DNA after WGA (whole genome amplification). Comparison of nonamplified and REPLI-g amplified DNA revealed error rates (mismatch, high-quality error, indels, or chimeras) in a similar percentage range. (Alignment comparison performed using SMALT [Welcome Trust Sanger Institute]).|Amplification of genomic DNA using the REPLI-g Mini Kit involves 3 basic steps. First, the sample (10 ng purified genomic DNA, 0.5 µl whole blood or tissue culture cells) undergoes gentle alkaline denaturation, avoiding fragmentation and damage of template DNA. Next the sample is neutralized, and finally incubated with REPLI-g master mix at 30°C.|Twenty DNA samples amplified using REPLI-g technology, without subsequent DNA purification, were subjected to genotyping analysis using 3 STR loci (CSF1PO, TPOX, and THOI). Results were compared with those obtained for unamplified genomic DNA. The DNA was separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and visualized by silver staining. A lane with one band represents a homozygote, while a lane with two bands represents a heterozygote for the specific STR locus.|Ph 29 polymerase moves along the DNA template strand displacing the complementary strand. The displaced strand becomes a template for replication, enabling high yields of high-molecular-weight DNA to be generated.|[A] Upon encountering secondary DNA structures, Taq polymerase may pause synthesis, slip, or dissociate from the template. This can result in inaccurate DNA amplification, incomplete loci coverage, and short fragment sizes. [B] REPLI-g Kits utilize Phi29 polymerase, which displaces secondary structures enabling accurate and highly uniform amplification of the entire genome.|The relative representation of eight loci was determined using real-time quantitative PCR for DNA amplified using [A] REPLI-g technology, [B] DOP-PCR, and [C] PEP. Locus representation was determined by comparison to 1 µg of unamplified control DNA. (Dean, F.B. et al. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261. © 2002 National Academy of Sciences, USA.)|Real-time PCR was performed on 47 human loci (2 loci on each autosomal pair, 2 loci on the X chromosome[s], and 1 locus on the Y chromosome) from 44 different samples amplified using REPLI-g technology. Each sample was amplified approximately 10,000-fold, with a maximum bias of representation between the loci being only 6-fold.|Various amounts of human genomic DNA were amplified in a standard REPLI-g Midi Kit reaction and aliquots taken at the indicated timepoints. The yield of amplified DNA from a 50 µl reaction was approximately 40 µg, regardless of the amount of starting material.|DNA amplified using REPLI-g technology, without subsequent purification, was subjected to SNP genotyping at 2 randomly selected loci (WIAF-1004 and WIAF-622) using a TaqMan analysis. Tight clusters of alleles allow reliable determination of genotyping of homo- and heterozygote genotypes.|
Performance
様々なサンプルから高収量で得られ、多くのアプリケーションに最適 REPLI-g Mini Kitは、ゲノムDNA、新鮮血あるいは乾燥血液、新鮮あるいは凍結組織、細胞を含む様々な臨床あるいは非臨床研究サンプルを使用できます。50 µlの反応液あたりの典型的なDNA収量は一定して10 µgで(図“どのようなタイプのサンプルでも一定したDNA収量”)、テンプレートDNAの量に関係なく増幅DNAが均一な収量で通常得られます(図“様々な量のテンプレートから均一なDNA収量”)。変動するテンプレート濃度から一定したDNA収量が得られることは常に重要ですが、遺伝子解析を続けて行なうことが必要なハイスループットアプリケーションではDNA濃度の付加的な測定や調整なしに実施できることは特に不可欠な要素です。 REPLI-g増幅DNAの平均的な長さは通常10 kb以上、2 kbから100 kbの間で、複雑な制限酵素解析やロングレンジPCRなどのダウストリームアプリケーションにも利用可能です。 REPLI-g増幅DNAはTaqManプライマー/プローブを用いたSNPジェノタイピング(図“ 信頼できるSNPジェノタイピング ”)、シークエンシング、STR/マイクロサテライト解析(図“正確なジェノタイピング”)などのジェノタイピング・アプリケーションに最適です。 次世代シークエンシングで良好な結果 多くの論文が、REPLI-g増幅DNAを使用して、腫瘍細胞のエクソームおよび全ゲノムシークエンスからメタゲノミクス研究、単一細胞分析にまでに及ぶ次世代シーケンシング(NGS)アプリケーションで良好な結果が得られたことを証明しています(REPLI-gを使用しNGSで良好な結果が得られた最新の論文に関しては弊社のホームページでWGAのリソースページをご覧ください)。NGSとアレイアプリケーションのために全ゲノム増幅されたDNAを使用することが議論されてきたので、私たちはこれらのダウンストリームアプリケーションのために増幅DNAを使用した場合の結果に影響を及ぼす可能性のある要因を検出しました。その結果、スタートサンプルの品質がダウンストリームやNGS実験の品質に大きく影響することが判明しました。低い品質のDNA(分解したDNAなど)あるいは長期保存した組織から得られた増幅DNAでは信頼できる結果が得られないことがあります(データ未提示)。しかし、 インタクト細胞あるいは非劣化の精製DNAでREPLI-gテクノロジーを用いて行なったWGAは、精製したgDNAで得られたものと同等であることを示しています。ゲノム遺伝子座配列の塩基配列解析率とアライメント比較は、WGAの後のジャンクDNAレベルが最小であることを示し、エラー率は増幅DNAとゲノムDNAの両方で同様の比率の範囲内にあります(図“精製gDNAあるいはREPLI-g増幅DNAで同等のNGS結果”)。 信頼性の高い全ゲノム増幅 REPLI-gテクノロジーは全ゲノム領域において均一なDNA増幅を実現します。Phi29ポリメラーゼはゲノムDNAテンプレートから解離せずに最高70 kbまでを複製します(図“REPLI-g増幅の模式図”)。PCRベースの全ゲノム増幅(WGA)テクノロジーとは対照的に、Phi29ポリメラーゼは3 '→5'exonucleaseプルーフリーディング活性を持ち、複製プロセス中には、Taq DNAに比べて最高1000倍の高いフィデリティを維持します。キットに付属のエキソヌクレアーゼ耐性プライマーは高収量のDNA産物を確保し、WGAバッファーシステムは非常に長い読み取りと、バイアスのない遺伝子座提示のために至適化されています。 PCRベースのWGA法より優れたREPLI-g 従来のゲノムDNAの増幅方法では、EBV形質転換細胞株を作成する時間のかかるプロセスのあと、ランダムあるいはdegenerate oligonucleotide-primed PCRを用いて全ゲノム増幅を行ないます。また、一般的に他のメーカーによって使用されるPCRベースの方法(例えば、DOP-PCRおよびPEP)は、非特異的な増幅アーティファクトを生成し、遺伝子座の不完全なカバレッジが生じることがあります。いくつかの例では、多くのダウンストリームアプリケーションで使用することはできない1 kb未満のDNAが生成されることがあります。
一般的に、得られたDNAはフィデリティの低いTaq DNAポリメラーゼを使用したためにはるかに高い変異率をもち、これは単一塩基対変異、STRの縮小および増加などのエラーが発生しやすい増幅につながります。これらの欠点とは対照的に、REPLI-gはゲノム全体にわたり均一性の高い増幅を提供し、最小限の遺伝子座バイアスと最小の変異率を実現します(図“REPLI-gテクノロジーを用いて全ゲノム領域を均一かつ正確に増幅”および“均一かつ正確な全ゲノム増幅”)。
Principle
ユニークなREPLI-gテクノロジーは、ゲノム遺伝子座を均一に増幅するために穏やかなアルカリ変性ステップと組み合わされたMultiple Displacement Amplification(MDA)を使用して、複雑なゲノムDNAを増幅するために革新的でフィデリティの高い酵素Phi 29 ポリメラーゼを使用しています。REPLI-g Mini Kitの典型的な収量は最大10μgであり、同じプロトコールに基づいており、同じ反応ボリュームを使用しているため、REPLI-g Midi Kitを使用してニーズに応じてスケールアップすることが可能です。 REPLI-gは簡単な反応セットアップと約15分と非常に短いマニュアルでの作業時間なので、微量あるいは貴重なサンプルから完全かつバイアスのない増幅が必要な場合には、簡単かつ信頼性の高い方法です。
増幅原理
REPLI-gはMultiple Displacement Amplification(MDA)と呼ばれる等温ゲノム増幅を使用しています。これは変性DNAにランダムヘキサマーを結合し、次に酵素Phi29ポリメラーゼを用いて一定の温度で鎖置換合成を行ないます。テンプレートとして機能する各置換鎖で追加のプライミングが起こり、高収量の増幅DNAが得られます(図“REPLI-g 増幅の模式図”)。ファージ由来の酵素であるPhi 29ポリメラーゼは、3 '→5'エキソヌクレアーゼ活性(プルーフリーディング活性)を有するDNAポリメラーゼで、 Taq DNAポリメラーゼに比べて1000倍も高いフィデリティを実現します。ユニークで最適化されたREPLI-gバッファーにより、Phi29ポリメラーゼはヘアピンループなどの二次構造を容易に解離し、それによって増幅中のポリメラーゼのスリッピング、停止、解離を防止します。これにより100 kbまでのバイアスのないDNAフラグメントの生成が可能です(図“Phi29 ポリメラーゼでバイアスのない増幅”)。
DNAのアルカリ変性
酵素による増幅を行なう前にゲノムDNAは高温(熱インキュベーション)または高pH(化学的アルカリ性インキュベーション)でのインキュベーションのような過酷な方法を使用して変性させる必要があります。REPLI-g Midi Kitは穏やかなアルカリ性インキュベーションを使用し、DNAのフラグメント化や脱塩基部位が非常に少ない均一なDNA変性を可能にします。この結果、非常に高い整合性をもつ増幅DNAが得られ、増幅されたフラグメントの長さを最大限に引き出し、ゲノム遺伝子座と配列が均一に表現されます。REPLI-g Mini Kitを使用すると、偽陽性または陰性のデータのない信頼できる結果がその後のダウンストリームアプリケーションで確保されますが、熱による変性を使用する他のWGAテクノロジーではテンプレートDNAを損傷し、バイアスがあり実際より少量の遺伝子座として提示されます(図“熱およびアルカリによる変性の遺伝子座への影響”)。
Procedure
簡単な1チューブでの操作
REPLI-g Mini Kitはシンプルで信頼性の高い方法を使用し、単離された少量の標的ゲノムDNA、あるいは全血、乾燥血液カード、バフィコート、および組織培養細胞から直接、正確なゲノム増幅を行ないます。(図“REPLI-g MiniおよびMidi 操作”)。サンプルの溶解とDNA変性を行なう溶解バッファーの添加後、短時間インキュベートします(図“REPLI-g MiniおよびMidi 操作”)。中和後、マスターミックス(REPLI-g Mini DNA Polymeraseを含む)を添加し、30℃で一晩の等温増幅反応を行ないます。REPLI-gで増幅したDNAは–20℃で長期間の保存が可能で、悪影響はありません(図“長期安定性”)。
専用のREPLI-g全製品群からお客様のニーズに合ったREPLI-g Kitをお選びください(表1)。
表1.各種REPLI-g Kits
| サンプルタイプ |
精製gDNA、血液、細胞(その他のサンプルタイプ用プロトコールはwww.qiagen.comをご覧ください) |
精製gDNA、血液、細胞 |
FFPE組織、FFPE組織から精製したgDNA |
精製したgDNA |
| サンプル量 |
>10 ng gDNA、0.5 µlの血液あるいは細胞(>細胞600個/µl) |
>10 ng gDNA、0.5 µlの血液あるいは細胞(>細胞600個/µl) |
切片(直径1 cm、厚さ10~40 µm); >100 ng gDNA |
>1 ng 精製gDNA |
| 収量(µg/反応) |
10 |
7~10 |
40 |
8 |
標準収量:≤10;高収量:≤40 |
3~5 |
| 反応時間(時間) |
10~16 |
1.5 |
8~16 |
12~16 |
標準収量:4;高収量:10 |
8 |
| 手作業時間(分) |
15
|
15
|
15
|
15
|
40
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15
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| フォーマット |
チューブ |
チューブ |
チューブ |
プレート |
チューブ |
チューブ |
Applications
REPLI-gを用いて増幅したDNAは、以下のようなアプリケーションに最適です。 - TaqManプライマー/プローブセットを用いたSNPジェノタイピング
- qPCRおよびPCRベースの変異検出
- 次世代シークエンシング
- STR/マイクロサテライト解析
- サンガーシークエンス
- RFLPおよびサザンブロット解析
- Comparative Genome Hybridization(CGH法)などのアレイテクノロジー
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Feature
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Specifications
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Amplification
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Whole genomic DNA
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Applications
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Genotyping, hybridization, RFLP
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Denaturation step
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Alkaline
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Maximum input volume
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>10 ng DNA, 0.1– 0.5 µl whole blood, >600 cells/µl
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Minimal pipetting volume needed
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0.5 µl
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Quality assessment
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No
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Reaction time
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8–16 hours (overnight)
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Reaction volume
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50 µl
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Samples per run (throughput)
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Mid
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Starting amount of DNA
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>10 ng purified genomic DNA
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Starting material
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Genomic DNA, blood, cells, tissue
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Technology
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Multiple Displacement Amplification (MDA)
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Yield
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10–40 µg
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For whole genome amplification from purified genomic DNA, blood, and cells
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Show details
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Images
Consistent DNA yields using any sample type.
Various starting materials, including genomic DNA, and heparin- and EDTA-preserved whole blood, were amplified using REPLI-g Midi and Mini Kits. Typical yields of 40 µg (Midi Kit) and 8–10 µg (Mini Kit) were obtained.
Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.
Genomic DNA samples (10 ng) were denatured using heat (95°C) or the standard REPLI-g Kit alkaline lysis protocol. After amplification using REPLI-g DNA Polymerase, the CT values of 2 loci were compared between samples. The low CT values of loci amplified using the REPLI-g Kit alkaline lysis protocol indicate better locus representation, meaning there has been no loss of sequence information at these loci.
Consistent long-term stability.
Real-time PCR of REPLI-g amplified DNA samples stored in 4 different formats at –20°C for the indicated time periods. Two loci, [A] locus A and [B] locus B, were assayed for each sample. gDNA: genomic DNA not amplified with REPLI-g. Storage formats: 50 µl REPLI-g reactions: 1) without further manipulation ("50 µl REPLI-g"); 2) aliquoted to 5 µl volumes ("5 µl REPLI-g"); 3) purified with QIAamp Mini Kit ("50 µl QIAamp purified REPLI-g"); and 4) diluted to a concentration of 50 ng/µl (50 µl diluted REPLI-g").
Comparable NGS (next-generation sequencing) results obtained using purified gDNA or REPLI-g amplified DNA.
Whole genome sequencing of the Bacillus subtilis genome was performed. For analysis, 2 μg of genomic DNA or DNA amplified from 105 cells using the REPLI-g Midi Kit was sheared into 300 bp fragments. For library preparation, 1 μg of each was used. Sequencing was performed on the Illumina MiSeq instrument. [A] Comparable sequence coverage was observed for both gDNA and REPLI-g amplified DNA. [B] Alignment comparison of the genomic loci sequence demonstrates comparably high percentage of alignment for REPLI-g amplified DNA in comparison to the gDNA, which is an indication of minimized levels of junk DNA after WGA (whole genome amplification). Comparison of nonamplified and REPLI-g amplified DNA revealed error rates (mismatch, high-quality error, indels, or chimeras) in a similar percentage range. (Alignment comparison performed using SMALT [Welcome Trust Sanger Institute]).
REPLI-g Mini and Midi procedure.
Amplification of genomic DNA using the REPLI-g Mini Kit involves 3 basic steps. First, the sample (10 ng purified genomic DNA, 0.5 µl whole blood or tissue culture cells) undergoes gentle alkaline denaturation, avoiding fragmentation and damage of template DNA. Next the sample is neutralized, and finally incubated with REPLI-g master mix at 30°C.
Accurate genotyping.
Twenty DNA samples amplified using REPLI-g technology, without subsequent DNA purification, were subjected to genotyping analysis using 3 STR loci (CSF1PO, TPOX, and THOI). Results were compared with those obtained for unamplified genomic DNA. The DNA was separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and visualized by silver staining. A lane with one band represents a homozygote, while a lane with two bands represents a heterozygote for the specific STR locus.
Schematic representation of REPLI-g amplification.
Ph 29 polymerase moves along the DNA template strand displacing the complementary strand. The displaced strand becomes a template for replication, enabling high yields of high-molecular-weight DNA to be generated.
Unbiased amplification with Phi29 polymerase.
[A] Upon encountering secondary DNA structures, Taq polymerase may pause synthesis, slip, or dissociate from the template. This can result in inaccurate DNA amplification, incomplete loci coverage, and short fragment sizes. [B] REPLI-g Kits utilize Phi29 polymerase, which displaces secondary structures enabling accurate and highly uniform amplification of the entire genome.
Highly representative amplification.
The relative representation of eight loci was determined using real-time quantitative PCR for DNA amplified using [A] REPLI-g technology, [B] DOP-PCR, and [C] PEP. Locus representation was determined by comparison to 1 µg of unamplified control DNA. (Dean, F.B. et al. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261. © 2002 National Academy of Sciences, USA.)
Consistent and accurate whole genome amplification.
Real-time PCR was performed on 47 human loci (2 loci on each autosomal pair, 2 loci on the X chromosome[s], and 1 locus on the Y chromosome) from 44 different samples amplified using REPLI-g technology. Each sample was amplified approximately 10,000-fold, with a maximum bias of representation between the loci being only 6-fold.
Uniform DNA yield from various amounts of template.
Various amounts of human genomic DNA were amplified in a standard REPLI-g Midi Kit reaction and aliquots taken at the indicated timepoints. The yield of amplified DNA from a 50 µl reaction was approximately 40 µg, regardless of the amount of starting material.
Reliable SNP genotyping.
DNA amplified using REPLI-g technology, without subsequent purification, was subjected to SNP genotyping at 2 randomly selected loci (WIAF-1004 and WIAF-622) using a TaqMan analysis. Tight clusters of alleles allow reliable determination of genotyping of homo- and heterozygote genotypes.
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