REPLI-g Midi Kit

微量あるいは貴重なサンプルから全ゲノムを均一に増幅

  • 40 µgの一定した収量実現する簡単な増幅
  • ゲノム遺伝子座のバイアスのない増幅
  • Multiple Displacement Amplification(MDA)による信頼できる結果
  • 増幅DNAはほとんどのダウンストリームアプリケーションに最適
  • 長期保存中にDNA分解のリスクなし

REPLI-g Midi Kit は、画期的なMultiple Displacement Amplification(MDA)テクノロジーを用いて微量のサンプルから全ゲノム増幅(WGA)に必要な至適化済みの試薬を提供します。50 μlの反応液から得られる典型的なDNA収量は 最高40 μgで、増幅産物の平均的な長さは10 kb以上です(2 kbから100 kbの間)。ユニークなREPLI-gテクノロジーは、精製されたゲノムDNAを含む微量あるいは貴重な各種サンプルから、または新鮮血あるいは乾燥血液、口腔スワブ、新鮮または凍結組織、細胞から直接に非常に均一なWGAを提供します。この簡単で信頼性の高い方法は正確でバイアスのないゲノム増幅を行ない、生成されたDNAはさらなる精製操作や定量が不要で、標識が不要なダウンストリームアプリケーション用に使用できます。PCR ベースのWGA テクノロジーとくらべて最高1,000 倍の高いフィデリティを示し、偽陽性や陰性の結果を排除します。WGA テクノロジーについては、弊社ウェブサイトの全ゲノム増幅に関する情報ページをご覧になるか、REPLI-g 製品については表1をご参照ください。

产品 Product no. 货号 目录价:
 
 
Show details
    varies
Can't order online?
To place an order via phone, email or for requesting a quote, please provide the product’s name, number and catalog number.
产品 货号 目录价:
REPLI g Human Control Kit 25
Human control DNA for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions
150090
33,60 €
加入购物车
REPLI g Midi Kit (25)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 40 µg per reaction)
150043
595,00 €
加入购物车
REPLI g Midi Kit (100)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 100 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 40 µg per reaction)
150045
1 990,00 €
加入购物车

REPLI-g Midi Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


任何类型样本都能获得高产量DNA。|高效的热变性和碱变性,位点序列信息不丢失。|长期保存具有稳定性。|基因组DNA和REPLI-g扩增获得的DNA,在二代测序中表现相当。|REPLI-g Mini and Midi实验流程。|准确的基因分型。|Schematic representation of REPLI-g amplification.|使用Phi29聚合酶进行无偏差的扩增。|REPLI-g技术的位点覆盖率出色。|稳定、准确的全基因组扩增。|多种样本量可获得稳定的DNA产量。|可靠的SNP基因分型。|
使用REPLI-g Midi and Mini Kits扩增各种起始材料,包括基因组DNA、肝素和EDTA保存的全血。常规产量为40 µg (Midi Kit) 和8–10 µg (Mini Kit)。|通过加热(95°C)或标准的REPLI-g Kit碱裂解法使基因组DNA样本(10 ng)变性。使用REPLI-g DNA Polymerase扩增后,比较样本2个位点的CT值。REPLI-g Kit碱裂解法扩增获得的位点CT值较低,表明这些位点的序列信息并未丢失。|对REPLI-g扩增的DNA样本进行real-time PCR,这些样本以4种不同形式在–20°C下保存了图示时间。检测每个样本的两个位点,[A]位点A和[B]位点B。gDNA:未用REPLI-g扩增的基因组DNA。保存形式:50 µl REPLI-g反应液:1) 未进一步处理("50 µl REPLI-g");2) 分装为5 µl体积("5 µl REPLI-g");3) 使用QIAamp Mini Kit纯化("50 µl QIAamp purified REPLI-g");4) 稀释至浓度为50 ng/µl ("50 µl diluted REPLI-g")。|对枯草芽孢杆菌的基因组进行全基因组测序。为进行分析,将2 μg基因组DNA、或REPLI-g Midi Kit从105个细胞扩增的DNA,剪切成300 bp大小的片段。每个取1 μg用于文库制备。在Illumina MiSeq仪器上进行测序。[A]基因组DNA和REPLI-g扩增的DNA得到的序列覆盖率相当。[B]基因组序列位点的比对表明,REPLI-g扩增的DNA的位点与基因组DNA相似度高,说明WGA(全基因组扩增)后DNA丢失水平较低。未扩增与REPLI-g扩增的DNA相比,错误率(错配、高级错误、缺失或嵌合体)在相同的比率范围。(使用SMALT [Welcome Trust Sanger Institute]进行比对。)|使用REPLI-g Mini Kit扩增基因组DNA包括3个基本步骤。首先,样品(10 ng纯化的基因组DNA,0.5 µl全血或组织培养细胞)需经过温和的碱变性,避免片段化和对模板DNA的损害。然后,样本被中和,最后再和REPLI-g预混液在30°C下孵育。|利用REPLI-g技术扩增20个DNA样本,后续不进行DNA纯化,直接对3个STR位点(CSF1PO、TPOX、和THOI)进行基因分型分析。将结果与为扩增的基因组DNA的基因型进行比对。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA,并用银染色。只有一条带的泳道代表纯合子,两条带的泳道表示该STR位点为杂合子。|Phi 29 polymerase moves along the DNA template strand displacing the complementary strand. The displaced strand becomes a template for replication allowing high yields of high-molecular–weight DNA to be generated.|[A]当遇到DNA二级结构时,Taq聚合酶可能停止合成、跳过或从模板上解离。这可能导致不准确的DNA扩增、不完整的位点覆盖和DNA片段短。[B]REPLI-g Kits使用Phi29聚合酶,可替换二级结构,对整个基因组进行准确和高度统一的扩增。|使用定量real-time PCR对DNA样本的8个位点进行检测,DNA样本分别使用[A]REPLI-g技术[B]DOP-PCR和[C]PEP技术扩增而来。位点是否存在是与1 µg未扩增的对照DNA比较而确定的。|对使用REPLI-g技术扩增而来的44个不同样本的47个人类位点(每个常染色体对2个位点,X染色体两个位点,Y染色体1个位点)进行real-time PCR。每个样本被扩增约10,000倍,而覆盖位点的最大偏差只有6倍。|不同量的人类基因组DNA在标准REPLI-g Midi Kit反应中扩增,在图示时间点取样。无论起始材料量的大小,从50 µl反应中扩增的DNA产量约为40 µg。|使用REPLI-g技术扩增的DNA不经纯化,使用TaqMan分析对2个随机选取的位点(WIAF-1004和WIAF-622)进行SNP基因分型。等位基因的紧密集群能可靠确定纯合子和杂合子的基因型。|
性能

様々なサンプルから高収量で得られ、多くのアプリケーションに最適

REPLI-g Midi Kitは、ゲノムDNA、新鮮血あるいは乾燥血液、新鮮あるいは凍結組織、細胞を含む様々な臨床あるいは非臨床研究サンプルを使用できます。50 µlの反応液あたりの典型的なDNA収量は一定して40 µgで(図“どのようなタイプのサンプルでも一定したDNA収量”)、テンプレートDNAの量に関係なく増幅DNAが均一な収量で通常得られます(図“様々な量のテンプレートから均一なDNA収量”)。変動するテンプレート濃度から一定したDNA収量が得られることは常に重要ですが、遺伝子解析を続けて行なうことが必要なハイスループットアプリケーションではDNA濃度の付加的な測定や調整なしに実施できることは特に不可欠な要素です。

REPLI-g増幅DNAの平均的な長さは通常10 kb以上、2 kbから100 kbの間で、複雑な制限酵素解析やロングレンジPCRなどのダウストリームアプリケーションにも利用可能です。REPLI-g増幅DNAはTaqManプライマー/プローブを用いたSNPジェノタイピング(図“信頼できるSNPジェノタイピング ”)、シークエンシング、STR/マイクロサテライト解析(図“正確なジェノタイピング”)。

次世代シークエンシングで良好な結果

多くの論文が、REPLI-g増幅DNAを使用して、腫瘍細胞のエクソームおよび全ゲノムシークエンスからメタゲノミクス研究、単一細胞分析にまでに及ぶ次世代シーケンシング(NGS)アプリケーションで良好な結果が得られたことを証明しています(REPLI-gを使用しNGSで良好な結果が得られた最新の論文に関しては弊社のホームページでWGAのリソースページをご覧ください)。NGSとアレイアプリケーションのために全ゲノム増幅されたDNAを使用することが議論されてきたので、私たちはこれらのダウンストリームアプリケーションのために増幅DNAを使用した場合の結果に影響を及ぼす可能性のある要因を検出しました。その結果、スタートサンプルの品質がダウンストリームやNGS実験の品質に大きく影響することが判明しました。低い品質のDNA(分解したDNAなど)あるいは長期保存した組織から得られた増幅DNAでは信頼できる結果が得られないことがあります(データ未提示)。しかし、インタクト細胞あるいは非劣化の精製DNAでREPLI-gテクノロジーを用いて行なったWGAは、精製したgDNAで得られたものと同等であることを示しています。ゲノム遺伝子座配列の塩基配列解析率とアライメント比較は、WGAの後のジャンクDNAレベルが最小であることを示し、エラー率は増幅DNAとゲノムDNAの両方で同様の比率の範囲内にあります(図“精製gDNAあるいはREPLI-g増幅DNAで同等のNGS結果”)。

信頼性の高い全ゲノム増幅

REPLI-gテクノロジーは全ゲノム領域において均一なDNA増幅を実現します。Phi29ポリメラーゼはゲノムDNAテンプレートから解離せずに最高70 kbまでを複製します(図“REPLI-g増幅の模式図”)。PCRベースの全ゲノム増幅(WGA)テクノロジーとは対照的に、Phi29ポリメラーゼは3 '→5'exonucleaseプルーフリーディング活性を持ち、複製プロセス中には、Taq DNAに比べて最高1000倍の高いフィデリティを維持します。キットに付属のエキソヌクレアーゼ耐性プライマーは高収量のDNA産物を確保し、WGAバッファーシステムは非常に長い読み取りと、バイアスのない遺伝子座提示のために至適化されています。

PCRベースのWGA法より優れたREPLI-g

従来のゲノムDNAの増幅方法は、EBV形質転換細胞株を作成する時間のかかるプロセスのあと、ランダムあるいはdegenerate oligonucleotide-primed PCRを用いて全ゲノム増幅を行ないます。また、一般的に他のメーカーによって使用されるPCRベースの方法(例えば、DOP-PCRおよびPEP)は、非特異的な増幅アーティファクトを生成し、遺伝子座の不完全なカバレッジが生じることがあります。いくつかの例では、多くのダウンストリームアプリケーションで使用することはできない1 kb未満のDNAが生成されることがあります。一般的に、得られたDNAはフィデリティの低いTaq DNAポリメラーゼを使用したためにはるかに高い変異率をもち、これは単一塩基対変異、STRの縮小および増加などのエラーが発生しやすい増幅につながります。これらの欠点とは対照的に、REPLI-gはゲノム全体にわたり均一性の高い増幅を提供し、最小限の遺伝子座バイアスと最小の変異率を実現します(図“REPLI-gテクノロジーを用いて全ゲノム領域を均一かつ正確に増幅”および“均一かつ正確な全ゲノム増幅”)。

原理

ユニークなREPLI-gテクノロジーは、ゲノム遺伝子座を均一に増幅するために穏やかなアルカリ変性ステップと組み合わされたMultiple Displacement Amplification(MDA)を使用して、複雑なゲノムDNAを増幅するために革新的でフィデリティの高い酵素Phi 29 ポリメラーゼを使用しています。REPLI-g Midi Kitの典型的な収量は最大40 μgであり、REPLI-g Mini Kitを使用してニーズに応じてスケールダウンすることが可能です。両方のキットは同じプロトコールに基づいており、同じ反応ボリュームを使用しています。REPLI-gの簡単な反応セットアップと約15分と非常に短い手作業時間により、微量あるいは貴重なサンプルから完全かつバイアスのない増幅が必要な場合に簡単で信頼性の高い方法になります。

増幅原理

REPLI-gはMultiple Displacement Amplification(MDA)と呼ばれる等温ゲノム増幅を使用しています。これは変性DNAにランダムヘキサマーを結合し、次に酵素Phi29ポリメラーゼを用いて一定の温度で鎖置換合成を行ないます。テンプレートとして機能する各置換鎖で追加のプライミングが起こり、高収量の増幅DNAが得られます(図“REPLI-g増幅の模式図”)。ファージ由来の酵素であるPhi 29ポリメラーゼは、3 '→5'エキソヌクレアーゼ活性(プルーフリーディング活性)を有するDNAポリメラーゼで、 Taq DNAポリメラーゼに比べて1000倍も高いフィデリティを実現します。ユニークで最適化されたREPLI-gバッファーにより、Phi29ポリメラーゼはヘアピンループなどの二次構造を容易に解離し、それによって増幅中のポリメラーゼのスリッピング、停止、解離を防止します。これにより100 kbまでのDNAフラグメントの生成が可能です(図“Phi29ポリメラーゼでバイアスのない増幅”)。

DNAのアルカリ変性

酵素による増幅を行なう前にゲノムDNAは高温(熱インキュベーション)または高pH(化学的アルカリ性インキュベーション)でのインキュベーションのような過酷な方法を使用して変性させる必要があります。REPLI-g Midi Kitは穏やかなアルカリ性インキュベーションを使用し、DNAの断片化や脱塩基部位が非常に少ない均一なDNA変性を可能にします。この結果、非常に高い整合性をもつ増幅DNAが得られ、増幅された断片の長さを最大限に引き出し、ゲノム遺伝子座と配列が均一に表現されます。REPLI-g Midi Kitを使用すると、偽陽性または陰性のデータのない信頼できる結果がその後のダウンストリームアプリケーションで確保されますが、熱による変性を使用する他のWGAテクノロジーではテンプレートDNAを損傷し、バイアスがあり実際より少量の遺伝子座として提示されます(図“熱およびアルカリによる変性の遺伝子座への影響”)。

操作流程

簡単な1チューブ操作

REPLI-g Midi Kitはシンプルで信頼性の高い方法を使用し、分離された少量の標的ゲノムDNA、あるいは全血、乾燥血液カード、バフィコート、および組織培養細胞から直接、正確なゲノム増幅を行ないます(図“REPLI-g MiniおよびMidi 操作)。サンプルの溶解とDNA変性を行なう溶解バッファーの添加後、短時間インキュベートします(図“REPLI-g MiniおよびMidi 操作”)。中和後、マスターミックス(REPLI-g Midi DNA Polymeraseを含む)を添加し、30℃で一晩の等温増幅反応を行ないます。REPLI-gで増幅したDNAは–20℃で長期間の保存が可能で、悪影響はありません(図“長期安定性”)。

専用のREPLI-g全製品群からお客様のニーズに合ったREPLI-g Kitをお選びください(表1)。

表1.各種REPLI-g Kits

  REPLI-g Mini  REPLI-g UltraFast Mini  REPLI-g Midi  REPLI-g Screening   REPLI-g FFPE REPLI-g Mitochondrial DNA 
サンプルタイプ  精製gDNA、血液、細胞(その他のサンプルタイプ用プロトコールはwww.qiagen.comをご覧ください) 精製gDNA、血液、細胞 FFPE組織、FFPE組織から精製したgDNA 精製したgDNA
サンプル量  >10 ng gDNA、0.5 µlの血液あるいは細胞(>細胞600個/µl)  >10 ng gDNA、0.5 µlの血液あるいは細胞(>細胞600個/µl)  切片(直径1 cm、厚さ10~40 µm); >100 ng gDNA  >1 ng 精製gDNA
収量(µg/反応) 10  7~10 40 8 標準収量:≤10;高収量:≤40  3~5
反応時間(時間)  10~16
 1.5
 8~16
 12~16
 標準収量:4;高収量:10
 8
手作業時間(分)  15
 15
 15
 15
 40
 15
フォーマット  チューブ  チューブ  チューブ  プレート  チューブ  チューブ
应用

REPLI-gを用いて増幅したDNAは、以下のようなアプリケーションに最適です:

  • TaqManプライマー/プローブセットを用いたSNPジェノタイピング
  • qPCRおよびPCRベースの変異検出
  • 次世代シークエンシング 
  • STR/マイクロサテライト解析
  • サンガーシークエンス
  • RFLPおよびサザンブロット解析
  • Comparative Genome Hybridization(CGH法)などのアレイテクノロジー

您无权限查看此资源

产品介绍与指南
1
常见问题
41
FAQ ID -1160
浏览
FAQ ID -1327
浏览
FAQ ID -1545
浏览
FAQ ID -1611
浏览
FAQ ID -1690
浏览
FAQ ID -2148
浏览
FAQ ID -654
浏览
FAQ ID -656
浏览
FAQ ID -663
浏览
FAQ ID -665
浏览
FAQ ID -667
浏览
FAQ ID -668
浏览
FAQ ID -669
浏览
FAQ ID -670
浏览
FAQ ID -671
浏览
FAQ ID -672
浏览
FAQ ID -673
浏览
FAQ ID -675
浏览
FAQ ID -678
浏览
FAQ ID -682
浏览
FAQ ID -683
浏览
FAQ ID -684
浏览
FAQ ID -685
浏览
FAQ ID -686
浏览
FAQ ID -690
浏览
FAQ ID -691
浏览
FAQ ID -692
浏览
FAQ ID -693
浏览
FAQ ID -694
浏览
FAQ ID -695
浏览
FAQ ID -701
浏览
FAQ ID -702
浏览
FAQ ID -704
浏览
FAQ ID -707
浏览
FAQ ID -708
浏览
FAQ ID -710
浏览
FAQ ID -711
浏览
FAQ ID -712
浏览
FAQ ID -713
浏览
FAQ ID -700
浏览
FAQ ID -3113
浏览
试剂盒操作手册
1
For whole genome amplification from purified genomic DNA, blood, and cells
显示更多
图片
Consistent DNA Yields Using any Sample Type.
任何类型样本都能获得高产量DNA。
使用REPLI-g Midi and Mini Kits扩增各种起始材料,包括基因组DNA、肝素和EDTA保存的全血。常规产量为40 µg (Midi Kit) 和8–10 µg (Mini Kit)。
Effect of Heat and Alkaline Denaturation on Loci Representation.
高效的热变性和碱变性,位点序列信息不丢失。
通过加热(95°C)或标准的REPLI-g Kit碱裂解法使基因组DNA样本(10 ng)变性。使用REPLI-g DNA Polymerase扩增后,比较样本2个位点的CT值。REPLI-g Kit碱裂解法扩增获得的位点CT值较低,表明这些位点的序列信息并未丢失。
Consistent long-term stability
长期保存具有稳定性。
对REPLI-g扩增的DNA样本进行real-time PCR,这些样本以4种不同形式在–20°C下保存了图示时间。检测每个样本的两个位点,[A]位点A和[B]位点B。gDNA:未用REPLI-g扩增的基因组DNA。保存形式:50 µl REPLI-g反应液:1) 未进一步处理("50 µl REPLI-g");2) 分装为5 µl体积("5 µl REPLI-g");3) 使用QIAamp Mini Kit纯化("50 µl QIAamp purified REPLI-g");4) 稀释至浓度为50 ng/µl ("50 µl diluted REPLI-g")。
Comparable NGS results obtained using gDNA or REPLI-g amplified DNA
基因组DNA和REPLI-g扩增获得的DNA,在二代测序中表现相当。
对枯草芽孢杆菌的基因组进行全基因组测序。为进行分析,将2 μg基因组DNA、或REPLI-g Midi Kit从105个细胞扩增的DNA,剪切成300 bp大小的片段。每个取1 μg用于文库制备。在Illumina MiSeq仪器上进行测序。[A]基因组DNA和REPLI-g扩增的DNA得到的序列覆盖率相当。[B]基因组序列位点的比对表明,REPLI-g扩增的DNA的位点与基因组DNA相似度高,说明WGA(全基因组扩增)后DNA丢失水平较低。未扩增与REPLI-g扩增的DNA相比,错误率(错配、高级错误、缺失或嵌合体)在相同的比率范围。(使用SMALT [Welcome Trust Sanger Institute]进行比对。)
REPLI-g Mini and Midi procedure
REPLI-g Mini and Midi实验流程。
使用REPLI-g Mini Kit扩增基因组DNA包括3个基本步骤。首先,样品(10 ng纯化的基因组DNA,0.5 µl全血或组织培养细胞)需经过温和的碱变性,避免片段化和对模板DNA的损害。然后,样本被中和,最后再和REPLI-g预混液在30°C下孵育。
Accurate Genotyping.
准确的基因分型。
利用REPLI-g技术扩增20个DNA样本,后续不进行DNA纯化,直接对3个STR位点(CSF1PO、TPOX、和THOI)进行基因分型分析。将结果与为扩增的基因组DNA的基因型进行比对。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA,并用银染色。只有一条带的泳道代表纯合子,两条带的泳道表示该STR位点为杂合子。
Schematic representation of REPLI-g amplification

Schematic representation of REPLI-g amplification.

Phi 29 polymerase moves along the DNA template strand displacing the complementary strand. The displaced strand becomes a template for replication allowing high yields of high-molecular–weight DNA to be generated.

Unbiased amplification with Phi29 polymerase
使用Phi29聚合酶进行无偏差的扩增。
[A]当遇到DNA二级结构时,Taq聚合酶可能停止合成、跳过或从模板上解离。这可能导致不准确的DNA扩增、不完整的位点覆盖和DNA片段短。[B]REPLI-g Kits使用Phi29聚合酶,可替换二级结构,对整个基因组进行准确和高度统一的扩增。
Highly representative amplification using REPLI-g technology
REPLI-g技术的位点覆盖率出色。
使用定量real-time PCR对DNA样本的8个位点进行检测,DNA样本分别使用[A]REPLI-g技术[B]DOP-PCR和[C]PEP技术扩增而来。位点是否存在是与1 µg未扩增的对照DNA比较而确定的。
Consistent and accurate whole genome amplification
稳定、准确的全基因组扩增。
对使用REPLI-g技术扩增而来的44个不同样本的47个人类位点(每个常染色体对2个位点,X染色体两个位点,Y染色体1个位点)进行real-time PCR。每个样本被扩增约10,000倍,而覆盖位点的最大偏差只有6倍。
Uniform DNA Yield from Various Amounts of Template.
多种样本量可获得稳定的DNA产量。
不同量的人类基因组DNA在标准REPLI-g Midi Kit反应中扩增,在图示时间点取样。无论起始材料量的大小,从50 µl反应中扩增的DNA产量约为40 µg。
Reliable SNP genotyping
可靠的SNP基因分型。
使用REPLI-g技术扩增的DNA不经纯化,使用TaqMan分析对2个随机选取的位点(WIAF-1004和WIAF-622)进行SNP基因分型。等位基因的紧密集群能可靠确定纯合子和杂合子的基因型。