PyroMark PCR Kit

パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅
  • 様々なサンプルからゲノムDNAおよびBisulfite変換DNAを高い特異性で増幅
  • パイロシークエンス解析用に至適化済みのキット
  • 至適化不要で高収量のPCR産物
  • 室温でセットアップできる簡便なマスターミックス
  • 至適化済みのプロトコール

PyroMark PCR Kitはパイロシークエンス解析用に特別に至適化され、DNAテンプレートを変異検出、SNP検出、メチル化解析、シークエンシングなど様々なアプリケーション用に高い特異性で均一に増幅します。本キットは、特異性の高い増幅用に至適化済みのPyroMark Reaction BufferとHotStarTaq DNA Polymeraseからなる簡便なマスターミックスフォーマットでお届けします。さらに増幅困難なテンプレート(GCリッチなど)用に最適なQ-Solutionも入っています。PyroMark PCR KitにはまたCoralLoad Concentrateが同梱されており、パイロシークエンス解析において信頼できる結果が得られます。CoralLoad Concentrateには2種類のマーカー色素が入っているので、パイロシークエンス解析を行なう前にPCR産物をすぐにゲルにロードしチェックできます。

Product Product no. Cat. no. List price:
 
 
Show details
    varies
Can't order online?
To place an order via phone, email or for requesting a quote, please provide the product’s name, number and catalog number.
Product Cat. no. List price:
PyroMark PCR Kit (200)
For 200 reactions: 2x PyroMark PCR Master Mix (includes HotStarTaq DNA Polymerase and optimized PyroMark Reaction Buffer containing 3 mM MgCl2 and dNTPs), 10x CoralLoad Concentrate, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2, and RNase-Free Water
978703
€ 260,00
Add to cart
PyroMark PCR Kit (800)
For 800 reactions: 2x PyroMark PCR Master Mix (includes HotStarTaq DNA Polymerase and optimized PyroMark Reaction Buffer containing 3 mM MgCl2 and dNTPs), 10x CoralLoad Concentrate, 5x Q-Solution, 25 mM MgCl2, and RNase-Free Water
978705
€ 970,00
Add to cart
The PyroMark PCR Kit is intended for molecular biology applications. This product is not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.
  • Main Image Navi
CoralLoad Concentrate.|PCR optimized for Pyrosequencing.|Superior results with PyroMark PCR Kit.|Increased specificity of primer annealing.|
[A] CoralLoad Concentrate contains [B] 2 gel-tracking dyes, enabling immediate gel loading of PCR products for easy visualization of DNA migration.|The PyroMark PCR Kit ensures greater amplification efficiency with high specificity. This results in [A] higher Pyrogram peaks and more reliable Pyrosequencing results, compared with [B] standard PCR.|Template DNA (10 ng) was amplified with the PyroMark PCR Kit in parallel with PCR master mixes from Suppliers R, I, and AII. Primers specific for Cyclin A1, BARHL1, MINT1, or DNMT3b were designed with the PyroMark Assay Design Software 2.0, and an annealing temperature gradient ranging from 48.4°C to 60.1°C was used. The PyroMark PCR Kit consistently produced higher amplicon yields and fewer nonspecific PCR products than the other master mixes, ensuring reliable results from downstream Pyrosequencing analyses. M: 50 bp ladder|K+ binds to the phosphate groups (P) on the DNA backbone, stabilizing the annealing of the primers to the template. NH4+, which exists both as the ammonium ion and as ammonia under thermal-cycling conditions, can interact with the hydrogen bonds between the bases (B), destabilizing principally the weak hydrogen bonds at mismatched bases. The combined effect of the two cations maintains the high ratio of specific to nonspecific primer-template binding over a wide temperature range.|
Performance
最適な割合のカリウムとアンモニウム塩を含有するPyroMark PCR Master Mixは、プライマーとテンプレートの特異的なアニーリングを促進すると同時に非特異的なアニーリングを抑制します。テンプレート量が非常に少ない場合でも、最大収量の特異的産物が得られます(図 "PyroMark PCR Kitで優れた結果")。このように至適化されたテンプレートの増幅によってPyrogramのピークが高くなり、パイロシークエンス法の結果がさらに信頼できるものとなります(図 "パイロシークエンス法に至適化されたPCR")。

Principle
PyroMark PCR Master Mix

PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅を可能にします。全てのPCRサイクルのアニーリングステップ中、画期的なバッファー成分により、特異的なプライマー結合の比率が非特異的な結合に比べて高くなります。ゲノムDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、主に3種類の塩基で構成されるDNAがつくられます。このPCRバッファーは、KClと(NH4)2SO4のユニークな配合比により、従来のPCRバッファーに比べ幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密なプライマーアニーリング条件を実現します。塩をバランスよく配合したPyroMark PCR Kitのユニークなマスターミックスは、特異的なプライマー結合を確実にし、ミスプライミングを防ぎます。この特殊な配合組成は、ビオチン化プライマーの過剰な蓄積も防ぎ、パイロシークエンス反応を妨害する可能性があるアーティファクトの発生を最小限に抑えます。高収量の特異的なPCR産物が得られることで、パイロシークエンス法の結果が信頼できるものになります。 

各PCRサイクルのアニーリングステップの間、このバッファー組成により、プライマーの非特異的結合に対する特異的結合の比が高くなります(図 "プライマーのアニーリングにおける特異性が増加")。本製品のPCRバッファーは、独自のバランスでKClと(NH4)2SO4を含んでおり、従来のPCRバッファーと比べて幅広い範囲のアニーリング温度とMg2+ 濃度条件で、厳密なプライマーアニーリングが可能になります。アニーリング温度やMg2+ 濃度を変化させてのPCR最適化実験は、通常は必要ありません。

HotStarTaq DNA Polymerase

マスターミックス中のHotStarTaq DNA Polymeraseは、QIAGENの組み換えTaq DNA Polymerase(94 kDa)を改良しています。HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により低温でのミスプライムによる増幅産物やプライマーダイマーの形成を抑制できます。HotStarTaq DNA Polymerase は、95 ℃、15分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。HotStarTaq DNA PolymeraseはPCRの特異性を高め、特異性の高いPCR産物の収量が増加します。全ての反応成分は室温で混和できるのでPCRセットアップが迅速かつ簡単に行なえます。

Q-Solution

PyroMark PCR Master Mixには画期的なPCR添加剤であるQ-Solutionが添付されており、DNAの変性環境を改善することで、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬により、高度な二次構造を持つテンプレートやGCリッチなテンプレートなどの増幅反応を促進します。DMSOのような汎用されているPCR添加物と異なり、Q-Solutionはどのようなプライマーテンプレートでも一定の濃度で作用し、毒性もなく、PCR純度は保証されています。Q-Solution存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

CoralLoad Concentrate

2種類のマーカー色素とゲルローディング試薬が入った CoralLoad Concentrateがキットに添付されています(図 "CoralLoad Concentrate")。CoralLoad Concentrateを用いた際は、PCR産物を直接アガロースゲルにロードでき、ゲルローディングバッファーおよびマーカー色素を前もって添加する必要がありません。CoralLoad ConcentrateをPCRに添加しても、増幅感度や特異性に影響しません。CoralLoad Concentrate存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

 

Procedure

PyroMark PCR Kit は、パイロシークエンス解析用に至適化されたDNAテンプレートのPCR増幅を実現します。テンプレートDNAを便利なPyroMark PCR Mastermix、Q-Solution、CoralLoad concentrate、および増幅プライマー(一方はビオチン化されているもの)と混合します。HotStarTaq DNA Polymerase は室温では不活化されているため、氷上で反応セットアップを行なう必要はありません。

Applications
パイロシークエンス法は様々な分野でますます重要になってきています。パイロシークエンス法は遺伝子変異やエピジェネティックな変異のパワフルで多様な解析を可能にし、病原体における薬剤耐性や遺伝子発現制御におけるエピジェネティックなDNAメチル化の役割、家畜における特定の表現型のための遺伝子マーカー、法医学サンプルのミトコンドリアDNA多型を調べることが可能です。PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析のための信頼できる特異性高いテンプレートアンプリコンを作製するために必要な試薬です。

You are not authorized to download the resource

References
0
Images
Ready-to-load PCR buffer
CoralLoad Concentrate.
[A] CoralLoad Concentrate contains [B] 2 gel-tracking dyes, enabling immediate gel loading of PCR products for easy visualization of DNA migration.
PCR amplification optimized for Pyrosequencing analysis
PCR optimized for Pyrosequencing.
The PyroMark PCR Kit ensures greater amplification efficiency with high specificity. This results in [A] higher Pyrogram peaks and more reliable Pyrosequencing results, compared with [B] standard PCR.
Superior PCR results with PyroMark PCR Kit
Superior results with PyroMark PCR Kit.
Template DNA (10 ng) was amplified with the PyroMark PCR Kit in parallel with PCR master mixes from Suppliers R, I, and AII. Primers specific for Cyclin A1, BARHL1, MINT1, or DNMT3b were designed with the PyroMark Assay Design Software 2.0, and an annealing temperature gradient ranging from 48.4°C to 60.1°C was used. The PyroMark PCR Kit consistently produced higher amplicon yields and fewer nonspecific PCR products than the other master mixes, ensuring reliable results from downstream Pyrosequencing analyses. M: 50 bp ladder
NH4+ and K+ cations in QIAGEN PCR buffers increase specific primer annealing
Increased specificity of primer annealing.
K+ binds to the phosphate groups (P) on the DNA backbone, stabilizing the annealing of the primers to the template. NH4+, which exists both as the ammonium ion and as ammonia under thermal-cycling conditions, can interact with the hydrogen bonds between the bases (B), destabilizing principally the weak hydrogen bonds at mismatched bases. The combined effect of the two cations maintains the high ratio of specific to nonspecific primer-template binding over a wide temperature range.