EpiTect HRM PCR Kit

メチル化状態の変化をHRM解析を用いて高い信頼性でスクリーニング
  • CpGメチル化状態の変化を正確に検出
  • 至適化なしに特異性の高いPCR増幅を実現
  • 蛍光色素EvaGreenにより明確な融解曲線
  • 簡便なマスターミックスと至適化済みのプロトコール
  • 新しいHRMメチル化アッセイを迅速かつ簡単に確立
EpiTect HRM PCR Kit は、HRM(High Resolution Melt)テクノロジーにより、Bisulfite変換DNAのCpGメチル化状態の変化について迅速なスクリーニングと正確な検出を実現します。至適化済みの本キットは、使いやすいマスターミックスフォーマットで、最適化されたHRMバッファー、HotStarTaq Plus DNA Polymerase、dNTPs、二本鎖DNA に結合する斬新な蛍光色素EvaGreenが含まれています。本キットはHRM 解析が行なえるリアルタイムPCR装置、Rotor-Gene Q およびRotor-Gene 6000、LightCycler 480 に対応しています。
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EpiTect HRM PCR Kit (100)
For 100 reactions: 2x EpiTect HRM Master Mix containing HotStarTaq Plus DNA Polymerase, EpiTect HRM PCR Buffer (with EvaGreen dye), dNTP Mix, and RNase-Free Water
59445
¥20,000

EpiTect HRM PCR Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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高感度な検出結果|様々なリアルタイムPCR機器でのメチル化解析|HRMによるAPC(adenomatosis polyposis coli)プロモーターのメチル化解析の原理|HRMテクノロジーの原理|
メチル化DNAと非メチル化DNAを様々な割合で混合した溶液をテンプレートとして用いた。APC遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドを増幅し、メチル化の程度をEpiTect HRM PCR Kit を用いてRotor-Gene QでのHRMメチル化解析により測定した。[A] HRM解析融解曲線、および [B] 50 %メチル化サンプルを基準として表示したDifference Plotを示す。メチル化DNA の割合が低くても検出できる。|メチル化DNA(M)と非メチル化DNA(U)を表示の割合で混合した溶液をテンプレートとして用いた。PTPN6 遺伝子(protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 6)のプロモーター領域にあるCpGアイランドを増幅し、メチル化の程度をHRMメチル化解析で測定した。[A] EpiTect HRM PCR Kit および Rotor-Gene Qを用いた際のDifference plot。[B] EpiTect HRM PCR Kit とLightCycler 480 を用いた際のDifference Plot および100 %非メチル化とメチル化DNA の融解ピーク(挿入図)。[C] Supplier R のHRM キット(3.5 mM MgCl2)とLightCycler 480 を用いた際のDifference Plot および100 %非メチル化とメチル化DNA の融解ピーク(挿入図)。キットは1.5 mM および3.5 mM MgCl2 (推奨されているMg2+ の最低および最高限度)の濃度でテストした。1.5 mM MgCl2 では増幅されなかった(データ未提示)。メチル化DNA をテンプレートとして使用した場合、3.5 mM MgCl2 での増幅では非特異的な増幅産物が得られ(赤い2つのピーク)、HRM解析に限界がある。|[A] ゲノムDNA — CpGアイランドの一部ではない全シトシンをXと表示する。メチル化シトシンを含んでいる可能性のあるCpGアイランドCpGをCGと示す。[B] ゲノムDNAのBisulfite変換 — 非メチル化シトシン残基は全てウラシルに変換されます。CpG アイランド内のシトシンはYで示されており、U に変換(非メチル化の場合)されているか、変換されていない(メチル化の場合)。|HRM解析は、温度の上昇によるdsDNAの解離状況に基づいている。dsDNAの融解はGC含有量に依存している。ATリッチな領域はより低温で融解する。|
パフォーマンス
斬新な蛍光色素、EvaGreen

EvaGreenは、二本鎖DNAに結合する色素です。EvaGreenのスペクトル特性は、SYBR® Green Iのスペクトル特性と類似しています。最大吸光度は500 nm、発光極大は530 nmです。SYBR® Green I とは異なり、EvaGreenはPCR 反応を阻害することなく高い飽和濃度で使用でき、GCリッチ領域とATリッチ領域への結合アフィニティーは同等で、配列による差はありません。これらの特性から、EvaGreenはあらゆるタイプのPCR 産物におけるHRM解析の理想的な色素です。

CpG メチル化状態の変化を高感度に検出

HRMによるCpGメチル化解析では、DNAの融解特性をHRM解析で測定する前に、DNAを完全にBisulfite変換しなければなりません。未知のサンプルはその融解温度の特性をスタンダードコントロールと比較することができます。即ち、EpiTect HRM PCR Kit の使用で得られる高い感度により、メチル化DNAが少量でも検出することができます(図 "高感度な検出結果")。

様々なリアルタイムPCR装置で一定した性能を実現

EpiTect HRM PCR Kit はHRM解析機能を有するリアルタイムPCR装置を使用することで非常に正確なメチル化解析結果をもたらします (図様々なリアルタイムPCR機器でのメチル化解析)。本キットは、Rotor-Gene Q、Rotor-Gene 6000 およびLightCycler 480 でテスト済みの最適なプロトコールが添付されています。Rotor-Gene Q の高度なHRMテクノロジーとEpiTect HRM PCR Kit の利点の組み合わせは優れたHRM解析を実現します。

原理

HRMは、二本鎖DNA(dsDNA)が温度上昇に伴い一本鎖DNA(ssDNA)に解離(融解)するという特性に基づき二本鎖PCR産物の特性を調べる革新的な手法です。Bisulfite変換したDNAを、変換特異的であるがメチル化特異的ではないプライマーを用いて増幅します。そのため、CpGアイランドに隣接し変換シトシンをいくつか含むようにプライマーを設計する必要があります(図 "HRMによるAPC(adenomatosis polyposis coli)プロモーターのメチル化解析の原理")。このようなプライマーは、確実にBisulfite変換DNAのみを増幅し、HRM解析においてCpGアイランドのメチル化および非メチル化CpG部位の判別が可能になります。

EvaGreenの蛍光を連続的に測定し、温度上昇に対してプロットしていきます。EvaGreenは、二本鎖DNAに結合している時だけ測定されます。そのため、HRM解析の開始時に高感度な蛍光検出が可能です。温度上昇に伴いDNAが融解するため、EvaGreenが解離し、蛍光強度はバックグラウンドレベルまで低下していきます。DNAのGCリッチな領域はより安定であるため、ATリッチな領域に比べてゆっくり融解し、高温で二本鎖の状態をより長時間維持しています(図 "HRMテクノロジーの原理”")。

HRM 解析はプローブを利用したメチル化アッセイに代わる簡単で経済的な方法です。PCR 産物は、その塩基配列、長さ、GC 含量に依存した融解温度を持ち、わずか1塩基の違いまで判別できます。

簡便なマスターミックスフォーマット

EpiTect HRM PCR Kit は、マスターミックスフォーマットなので、実験操作がより簡便で確実に行なえます。至適化済みの2x EpiTect HRMPCR Master Mix は特異性の高い増幅を実現します。さらに、本キットは、HRMによりBisulfite変換DNA中のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を迅速かつ高感度で解析できます。マスターミックスには、HotStarTaq Plus DNA Polymeras、EpiTect HRM PCR Buffer、dNTPs、EvaGreen 色素が最適な濃度で含まれています。

HotStarTaq Plus DNA Polymerase

HotStarTaq Plus DNA Polymerase を修飾したHotStarTaq Plus DNAPolymerase は、常温では非活性状態で、ポリメラーゼ活性がありません。これにより、低温でのPCRセットアップや最初のPCRサイクルで非特異的な増幅産物およびプライマーダイマーの形成を防ぎます。

至適化済み EpiTect HRM PCR Buffer

EpiTect HRM PCR Buffer は、PCRの各サイクルで特異的な増幅を実現します。バッファー中にはKCl と (NH4)4SO4 がバランスよく配合されており、プライマーテンプレートの特異的なアニーリングを促進します。同時に非特異的なアニーリングが抑制され、特異的なPCR産物の収量が最大限になり、最適なHRM解析が可能になります。時間のかかる Mg2+ 濃度の至適化実験なしに、高い収量で特異的な増幅が実現できます。

操作手順

二本鎖DNAに結合する蛍光色素であるEvaGreenの存在下で、標的配列を高コピー数になるようPCRで増幅します。この色素は、一本鎖DNA(ssDNA)とは相互作用しませんが、二本鎖DNAと結合し、結合すると鮮やかな蛍光を発します。増幅後、温度を上げ、EvaGreenの蛍光を連続的に測定し、温度に対してプロットします。

アプリケーション

EpiTect HRM PCR Kit はHRMテクノロジーを用いた信頼性が高く経済的なメチル化解析方法を実現し、エピジェネティクス研究におけるメチル化解析に非常に良好に使用できます。至適化済みのプロトコールにより、CpG部位のメチル化状態に関する情報を迅速かつ効率的に得ることができます。そのため、メチル化アッセイの確立が容易に行なえます。

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キットハンドブック
2

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HRM(High Resolution Melt)解析によるバイサルファイト変換DNAのCpGメチル化検出
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安全データシート
1
画像
Highly sensitive results with detection of even low percentages of methylated DNA
高感度な検出結果
メチル化DNAと非メチル化DNAを様々な割合で混合した溶液をテンプレートとして用いた。APC遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドを増幅し、メチル化の程度をEpiTect HRM PCR Kit を用いてRotor-Gene QでのHRMメチル化解析により測定した。[A] HRM解析融解曲線、および [B] 50 %メチル化サンプルを基準として表示したDifference Plotを示す。メチル化DNA の割合が低くても検出できる。
Methylation analysis on various real-time PCR instruments
様々なリアルタイムPCR機器でのメチル化解析
メチル化DNA(M)と非メチル化DNA(U)を表示の割合で混合した溶液をテンプレートとして用いた。PTPN6 遺伝子(protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 6)のプロモーター領域にあるCpGアイランドを増幅し、メチル化の程度をHRMメチル化解析で測定した。[A] EpiTect HRM PCR Kit および Rotor-Gene Qを用いた際のDifference plot。[B] EpiTect HRM PCR Kit とLightCycler 480 を用いた際のDifference Plot および100 %非メチル化とメチル化DNA の融解ピーク(挿入図)。[C] Supplier R のHRM キット(3.5 mM MgCl2)とLightCycler 480 を用いた際のDifference Plot および100 %非メチル化とメチル化DNA の融解ピーク(挿入図)。キットは1.5 mM および3.5 mM MgCl2 (推奨されているMg2+ の最低および最高限度)の濃度でテストした。1.5 mM MgCl2 では増幅されなかった(データ未提示)。メチル化DNA をテンプレートとして使用した場合、3.5 mM MgCl2 での増幅では非特異的な増幅産物が得られ(赤い2つのピーク)、HRM解析に限界がある。
Principle of methylation analysis of the APC promoter by HRM
HRMによるAPC(adenomatosis polyposis coli)プロモーターのメチル化解析の原理
[A] ゲノムDNA — CpGアイランドの一部ではない全シトシンをXと表示する。メチル化シトシンを含んでいる可能性のあるCpGアイランドCpGをCGと示す。[B] ゲノムDNAのBisulfite変換 — 非メチル化シトシン残基は全てウラシルに変換されます。CpG アイランド内のシトシンはYで示されており、U に変換(非メチル化の場合)されているか、変換されていない(メチル化の場合)。
Principle of HRM technology
HRMテクノロジーの原理
HRM解析は、温度の上昇によるdsDNAの解離状況に基づいている。dsDNAの融解はGC含有量に依存している。ATリッチな領域はより低温で融解する。