ウイルスRNA/DNAやバクテリアDNAとインターナルコントロールの高感度検出
  • 病原体ターゲットとインターナルコントロールを同時に検出
  • 5x マスターミックスでサンプル添加量を増加でき感度を増大
  • 陰性結果の明確化により、病原体の新規アッセイ系を簡便に構築
  • 低い陽性シグナルも明確に検出
  • スタンダードおよび高速サイクラーに対応する迅速な共通プロトコール

QuantiFast Pathogen +IC Kits は、配列特異的なプローブを用いたリアルタイムPCR あるいは1 ステップRT-PCR により、病原体核酸を高感度かつ高速に検出するために特化されています。偽陰性を排除した確実性の高い系を実現するために、最高4種類の研究対象の病原体ターゲット(ウイルス、バクテリア、真菌など)とインターナルコントロール(IC)をリアルタイムに検出するための試薬が各キットに入っています。キットフォーマットは2種類あります:Internal RNA Controlテンプレートとこれを検出するInternal Controlプライマー/プローブセットが入ったウイルスRNA 検出用QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit、あるいはInternal DNA Controlテンプレートとこれを検出するInternal Control プライマー/プローブセットが入ったウイルス/バクテリア/真菌DNA 検出用 QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit。両キットともに2種類の濃度のROX(チューブ)がキットに入っているので、どのようなリアルタイムサイクラーにも使用可能です。マスターミックスは2~8 ℃で保存でき、簡便に取り扱えます。

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QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit (100)
For 100 x 25 µl reactions: Master Mix, lyophilized Internal Control Assay, lyophilized Internal Control DNA, ROX Dye Solution, High-ROX Dye Solution, RNase-Free Water, Nucleic Acid Dilution Buffer, Buffer TE
211352
¥34,000
QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit (400)
For 400 x 25 µl reactions: Master Mix, lyophilized Internal Control Assay, lyophilized Internal Control DNA, ROX Dye Solution, High-ROX Dye Solution, RNase-Free Water, Nucleic Acid Dilution Buffer, Buffer TE
211354
¥100,000
QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit (400)
For 400 x 25 µl reactions: Master Mix, RT Mix, lyophilized Internal Control Assay, lyophilized Internal Control RNA, ROX Dye Solution, High-ROX Dye Solution, RNase-Free Water, Nucleic Acid Dilution Buffer, Buffer TE
211454
¥140,000
Internal Control DNA (High conc.)
For approximately 200 preps (depending on the elution volume): Lyophilized Internal Control DNA, Nucleic Acid Dilution Buffer
211392
¥10,000
Internal Control RNA (High conc.)
For approximately 200 preps (depending on elution volume): Lyophilized Internal Control RNA, Nucleic Acid Dilution Buffer
211492
¥10,000

QuantiFast Pathogen +IC Kits は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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陰性結果の正確な判定|Rotor-Gene QでBHV-1 の高感度検出|ノロウイルスを高感度検出|ABI 7500でBHV-1の高感度検出|プライマーの高速なアニーリング|QIAGEN Multiplex Kit|ユニークなPCRバッファー|QIAGEN Internal Control|SingleplexとDuplex検出で高い直線性と精度を実現|RNAスタンダードの正確な希釈および保存|
ウイルスRNAターゲットの2 種類の希釈液のduplicates をインターナルコントロールと共に、様々な量のPCR 阻害物質(フミン酸)の存在下でRotor-Gene Q で同時増幅した。[A] テンプレートを含まないコントロール(NTCs)はインターナルコントロールシグナルのリファレンスとなる。[B] ウイルスRNAターゲットおよびインターナルコントロールの増幅で良好な結果が得られた。[C]インターナルコントロールは低濃度の阻害物質が存在することを示唆している。[D]インターナルコントロールが検出できない場合は、阻害物質の存在により増幅が失敗したことを示している。|ウシヘルペスウイルス1型の連続希釈液(100 ~10-4)を調製し、singleplex のリアルタイムPCR あるいはInternal Controlを同時に検出するduplex のリアルタイムPCR により検出した。QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit を用いて、キットに同梱のプロトコールにしがたってRotor-Gene Q でPCRの至適化は行なわずにリアルタイムPCR を行なった。Duplex 反応には一定量のインターナルコントロールテンプレートが含まれている。各希釈液の解析はtriplicateで行なった。各希釈液は1つのreplicate で示す。|ノロウイルス転写RNAの連続希釈液(100 ~10-5)を調製し、singleplex のリアルタイムRT-PCR あるいはインターナルコントロールを同時に検出するduplex のリアルタイムRT-PCR により検出した。QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit を用いてRotor-Gene Q でPCRの至適化を行なわずにリアルタイムPCR を行なった。Duplex 反応には一定量のインターナルコントロールテンプレートが含まれている。各希釈液の解析はtriplicate で行なった。各希釈液あたり1 replicateを示している。|ウシヘルペスウイルス1型の連続希釈液(100 ~10-4)を調製し、singleplex のリアルタイムPCR あるいはインターナルコントロールを同時に検出するduplex のリアルタイムPCR により検出した。QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit を用いて、キットに同梱のプロトコールにしがたってABI 7500 でPCR の至適化は行なわずにリアルタイムPCR を行なった。Duplex 反応には一定量のインターナルコントロールテンプレートが含まれている。各希釈液の解析はtriplicate で行なった。各希釈液は1つのreplicateで示す。|[A] QuantiFast Buffer中のQ-Bondは、短い一本鎖化したDNAへのDNAポリメラーゼの結合アフィニティーを増大させるため、プライマーのアニーリング時間を数秒間に短縮できる。さらにDNAの融解をサポートするユニークなバッファー組成が、変性およびエクステンション時間を短縮する。[B] Q-Bond が存在しないと、プライマーとポリメラーゼが連続的にテンプレートに結合するのでプライマーのアニーリングに時間がかかる。|QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、簡単な操作でマルチプレックスリアルタイムRT-PCRを実現する。汎用されている方法に比べて、本キットはプライマー、プローブ、Mg2+Taq DNA polymeraseの濃度に対する至適化が不要で、リファレンス遺伝子に比べてターゲット遺伝子のコピー数が少ないアッセイでも同様。|[A] NH4+ イオンは非特異的なプライマーのテンプレートへのアニーリングを防ぐ。[B]画期的なPCR添加物であるFactor MP は、テンプレート周辺でのプライマー濃度を高める。K+ や他の陽イオンと共に、Factor MPは特異的に結合したプライマーを安定化し、HotStarTaq Plus DNA Polymeraseによる効果的なプライマーエクステンションを可能にする。|病原体ターゲットとインターナルポジティブコントロールを同時に抽出/増幅することは、PCR阻害物質あるいは偽陰性結果になるような他の問題を排除するためのより確実な方法である。QIAGEN Internal Controlは、増幅コントロールとしてPCR増幅前に添加できる。また、高濃度のQIAGEN Internal Controlは核酸抽出の際に抽出と増幅のコントロールとして添加できる。|ノロウイルスRNA のsingleplex 検出ならびにノロウイルス/IC のduplex 検出ともに1.0E+6までの希釈範囲で 高い直線性と精度が示された。エラーバーは、リアルタイムRT-PCRの3 replicates実験の±1 SDで示している。|QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer またはRNase フリー水を用いて、表記のようにRNA スタンダード(in vitro 転写RNA)の10 倍連続希釈溶液を調製した。これらの希釈液を調製直後(0 test)、あるいは -20 ℃で2 および4 週間保存後に1 ステップRT-PCR のテンプレートとして用いた。QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer を用いた場合のほうが、低いCT値が得られ、スタンダードの安定性も高い結果が得られた。|
パフォーマンス

QuantiFast Pathogen +IC Kitsを用いたマルチプレックスアッセイは、感度を損なうことなく複数のウイルスRNAやDNA ターゲットと添付のインターナルコントロールを同時に幅広い範囲で正確に検出できます(図”Rotor-Gene Qでノロウイルスの高感度検出”および“Singleplexと Duplex検出で高い直線性と精度を実現”)。本プロトコールはほとんどのサイクラーで迅速なサイクリング実験を高い信頼性で行なうために開発されました(図“Rotor-Gene QでBHV-1の高感度検出”および“ABI 7500でBHV-1の高感度検出”)。QuantiFast Pathogen +IC Kitsを用いて病原体ターゲットとインターナルコントロールの増幅を組み合わせることにより、陰性結果を明確に判定できるので、確実な病原体検出用のワークフローを実現します(図“陰性結果の正確な判定”)。

キットに同梱のQuantiTect Nucleic Acid Dilution Bufferは、希釈および反応セットアップ中にRNAやDNAスタンダードを安定化し、チューブやピペットチップの様なプラスチック表面への核酸の吸着を防ぎます。このバッファーによりウイルス核酸の定量に用いるスタンダードを正確に希釈でき、広範囲のCT 値において高い直線性が得られます。本バッファーはスタンダードの分解を防ぎ、長期保存を可能にします(図 “RNA スタンダードの正確な希釈および保存”)。

原理

陰性結果を明確に判定でき確実性の高い系を実現するため、インターナルコントロールと対象とする病原体の標的遺伝子を同時に検出するマルチプレックスリアルタイム検出用試薬が各QuantiFast Pathogen +IC Kitに入っています。別々の反応ではなく同一反応内でコントロール遺伝子と標的遺伝子を増幅することで、マニュアルでの作業によるエラーが最小限に抑えられ、遺伝子定量の信頼性が高くなります。

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、最初の実験でマルチプレックスリアルタイムPCRや1ステップ RT-PCRによる高感度で迅速な病原体核酸検出を実現します(フローチャート“QIAGEN Multiplex Kit”)。至適化されたマスターミックスにより、マルチプレックス反応でのPCR産物をシングル増幅反応に相当するPCR産物と同様の効率および感度で確実に増幅します。特別に開発された高速PCR用バッファーは、変性、アニーリングおよびエクステンション時間も顕著に短縮する斬新なQ-Bondを含有しています(図“プライマーの高速なアニーリング”)。画期的な合成添加剤Factor MPとK+およびNH4+のイオン配合比により、プライマーとプローブが核酸テンプレートに効率的かつ安定してアニーリングし、高いPCR効率と感度を実現します(図“ユニークなPCRバッファー”)。さらにSensiscript Reverse Transcriptaseのユニークな組成はウイルスRNAの高感度な逆転写を実現し、HotStarTaq Plus DNA Polymeraseは厳密なホットスタートにより非特異的な産物の生成を回避します。

QuantiFast Pathogen +IC Kitの成分
成分 特長 利点
5x QuantiFast Pathogen PCR Master Mix 高濃度マスターミックス 高感度な病原体検出用に高濃度で至適化済み テンプレート量を増やしアッセイ感度の増大を実現
HotStarTaq Plus DNA Polymerase 95℃、5分の活性化 室温で定量PCRのセットアップ
QuantiFast Pathogen Buffer NH4+とK+イオンの配合バランス 特異性の高いプライマーのアニーリングで信頼性の高いPCR結果
合成添加剤Factor MP 同一チューブ中の最高4遺伝子を高い信頼性でマルチプレックス解析
ユニークな添加剤Q-Bond PCR反応時間が短縮されるため迅速に結果が得られ、1日あたりの反応数を増やせる
Internal Control Assay インターナルコントロールテンプレート QuantiFast Pathogen PCR +IC KitのInternal Control DNAテンプレート 異なる病原体アッセイとともに使用できるユニバーサルなDNA増幅コントロール
QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC KitのInternal Control RNA 異なる病原体アッセイとともに使用できるユニバーサルなRNA増幅コントロール
Internal Control Assay MAX(HEX、VICなどに相当)で標識したプレミックスのプライマー/プローブセット(TaqManプローブ) 標的病原体に対するプライマーを阻害しない
追加のキット成分 QuantiFast Pathogen RT Mix* ユニークな組成のSensiscript Reverse Transcriptase 病原体RNAの高感度検出用に至適化済み
ROX Dye Solution Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステムでの蛍光補正用にpassive reference dye が別途チューブ包装。オプション:Agilent、Stratagene 装置で使用可能 ROX色素が必要なサイクラーで正確な定量。どのリアルタイムサイクラーでもPCRを妨害しない
High-ROX Dye Solution Applied Biosystems 7900およびStepOneリアルタイムPCR装置での蛍光補正用にpassive reference dyeが別途チューブ包装
QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer 核酸スタンダードの希釈および保存に最適な独自のバッファー組成 希釈や反応セットアップ中のRNAやDNAスタンダードを安定化し、チューブやピペットチップのようなプラスチック表面への核酸の吸着を防止
*QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit にのみ同梱
操作手順

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは研究対象の病原体とインターナルコントロールの検出を簡単な操作で実現します。本キットは即使用可能なマスターミックスを含み、ウイルスRNA(1ステップRT-PCR)あるいはウイルス/バクテリア/真菌DNA(PCR)のリアルタイム検出を実現します。反応条件やサイクリング条件の至適化は不要です。マスターミックスに病原体アッセイ(プライマーとプローブ)とInternal Control Assay およびInternal Control DNA/RNAをミックスするだけです。あるいは、Internal Control DNA/RNAを核酸精製プロセスで添加した場合は、Internal Control DNA/RNAの代わりにRNase フリー水を反応ミックスに添加します。その後、DNA あるいはRNA テンプレートを添加し、サイクラーで反応を開始します。ハンドブックにはTaqMan プローブ用に至適化されたプロトコールが入っており、様々なサイクラーで使用可能です。また推奨する色素の組み合わせも記載されています。

各QuantiFast Pathogen +IC Kits に入っている Internal Control Assay およびInternal Control DNA/RNA は、反応ミックスに直接添加して増幅コントロールとして使用します。あるいは核酸精製プロセスおよび増幅の両方をコントロールするために、インターナルコントロールを核酸精製プロセスで添加することも可能です。精製プロセスでインターナルコントロールを添加する場合は、高濃度のInternal Control DNA あるいはRNA(High conc.)を別途注文できます(図“QIAGEN Internal Control”)。

 

アプリケーション
QuantiFast Pathogen +IC Kitsは配列特異的なプローブを用いた高感度なリアルタイムPCRあるいは1ステップRT-PCRでインターナルコントロールを含む病原菌DNA/RNAの検出を実現します。本キットはQIAGEN、Applied Biosystems、Bio-Rad、Roche(キャピラリー式サイクラーを除く)、Agilent製サイクラーを含む様々なリアルタイム用サーマルサイクラーで使用可能です。
Feature
Specifications
Applications Pathogen Detection: Real-time PCR of viral, bacterial or fungal DNA (QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit) or one-step RT-PCR for detection of viral RNA (QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit)
Reaction type Real-time PCR or one-step RT-PCR including of an internal control (IC)
Real-time or endpoint Real-time
Sample/target type QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit: viral, bacterial or fungal DNA; QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit: viral RNA
Single or multiplex Duplex
SYBR Green I or sequence-specific probes Sequence-specific probes
Thermal cycler For most standard and fast real-time cylcers compatible with duplex PCR/RT-PCR, e.g. Rotor-Gene Q or cyclers from Agilent, Applied Biosystems, BioRad, Roche
With or without ROX Master Mix is provided without ROX dye, but 2 separate ROX solutions are included: High-ROX Dye Solution for use with ABI cyclers except ABI 7500, ROX Dye Solution (low ROX conc.) for use with ABI 7500 and other suppliers

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パンフレット
2
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優れた温度均一性を実現するリアルタイムPCR 装置
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FAQ
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FAQ ID -2448
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FAQ ID -2449
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FAQ ID -2453
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FAQ ID -2598
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FAQ ID -2599
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FAQ ID -2600
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FAQ ID -2601
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FAQ ID -2604
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FAQ ID -2606
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FAQ ID -2607
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FAQ ID -2609
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FAQ ID -2610
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FAQ ID -2682
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FAQ ID -539
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FAQ ID -589
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FAQ ID -2595
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FAQ ID -2596
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キットハンドブック
5

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配列特異的なプローブを用いた高感度な1 ステップリアルタイムRT-PCR によるウイルスRNA およびインターナルコントロールの検出
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配列特異的なプローブを用いた高感度リアルタイムPCR によるウイルス/バクテリアDNA およびインターナルコントロールの検出
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