PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q24 Advancedは配列の下流部位において読み取り数およびメチル化解析の信頼性とも増大する。この例は、一回のPyroMark Q24 Advanced CpG 反応で135回のヌクレオチド添加と16の異なるCpG部位の正確な解析を証明している。PyroMark Q24で正確にこれらのサイトの全てを分析するために、ひとつにつき3つの別々の分析を行なう必要がある。|DNAセグメントを増幅し、パイロシークエンス法のテンプレートとして使用するためにDNA鎖をビオチン化します。変性後、ビオチン化一本鎖PCRアンプリコンを単離し、シークエンシング用プライマーをハイブリダイズさせます。プライマーをアニーリングさせた一本鎖テンプレートに、酵素類であるDNA polymerase、ATP sulfurylase、luciferase 、apyrase および基質であるAPS（adenosine 5' phosphosulfate）、Luciferin と共にインキュベートします。|次に、反応液にdNTP（deoxribonucleotide triphosphate）を1種類ずつ添加します。テンプレート鎖の塩基に相補するdNTPである場合、DNA polymerase によりシークエンシング用プライマーにdNTPが付加されます。dNTPが取り込まれると、取り込まれたヌクレオチドの量に比例し、定量的にPPi （ピロリン酸）が遊離します。|ATP sulfurylase は、反応液に予め含有しているAPS（adenosine 5' phosphosulfate）と遊離したPPi によりATP を生成します。このATP はLuciferase を触媒として、このATPと反応し、Oxyluciferin へと変換され、ATPの量に比例して可視光が発生します。生じた発光は、CCDセンサにより検出され、ピーク波形（パイログラム；Pyrogram）として観察されます。各ピーク（光のシグナル）の高さは、取り込まれたヌクレオチド数に比例します。|Apyrase はヌクレオチドを分解する酵素で、反応に使用されなかったヌクレオチドおよびATPを分解します。分解が完了すると、次のヌクレオチドが添加されます。|dNTPの添加が連続して行なわれます。基質として通常のdATP（deoxyadenosine triphosphate）の代わりにdATPαS（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate）を使用します。これはdATPαS がLuciferase の基質にならず、DNA polymeraseにより効率的に使用されるからです。この連続工程により、相補的なDNA 鎖が伸長され、パイログラムにおける各発光ピークから塩基配列が決定できます。|Tホモポリマーの領域内または直後のCpGメチル化定量は非常に困難である。メチル化レベルはBisulfite変換後のCヌクレオチドと未変換のCヌクレオチドの比によって決定され、CからT への変換は長い増幅産物中のTホモポリマーの伸長をしばしば誘導し、これらの現象は頻繁に発生する。PyroMark Q24 Advancedは、Tホモポリマーの領域内または直後にあるCpG部位の信頼できる解析を可能にする。この例は、PyroMark Q24 Advancedを用いた8 Tヌクレオチドストレッチ内にあるCpG部位解析を示している。|PyroMark Q24 Advancedの改善されたアルゴリズムが、より長いリード、より明確なデータ、最小限のバックグラウンドをもたらした。PyroMark Q24（上のパネル）およびPyroMark Q24 Advanced（下のパネル）を同一アッセイでde novo シークエンシングに使用した。 青色のバーは確実に検出された塩基、黄色バーは正確に検出された塩基ではあるがユーザーによるチェックが必要な塩基、赤色のバーは信頼できない読み取りをそれぞれ示している。|SNPおよびその他の変異は互いに近くに位置していないことが多いため、従来のパイロシークエンシングケミストリーでは通常、解析する変異毎に個別のアッセイが必要になる。PyroMark Q24 Advancedの新しいケミストリーは一回のランでより長い配列解析を実現するため信頼できる解析が可能。この例は野生型と変異EGFRを90:10の比率で含むDNAサンプルの解析を示している。60回目のヌクレオチド添加後でさえも変異の定量は正確である。|PyroMark Q24 Advanced Systemは、パイロシークエンス法のワークフローが簡単かつ効率的になるようにデザインされている。アッセイのデザインからPCR増幅、シークエンシング用テンプレートの調製までの各段階は、パイロシークエンス法に最適化されたソフトウェア、キット、試薬、サンプル調製機器によりサポートされている。|PyroMark Q24 Avancedは最大24サンプルを迅速に解析するのに必要な全ステップを管理している。サンプルと試薬をロードし、ランファイルをアップロードするだけで自動で解析が行なわれる。PyroMark Q24 Advancedは、 試薬およびヌクレオチドを各ウェルに正確に分注し、放出された光シグナルを24個のCCDセンサーで検出する。 ひとつのウェルにつき1個のセンサーを使用するので、シグナルのクロスオーバーが起こらない。|PyroMark Q24 Advancedは、単体機器として設計されており、ラボ内のどこにでも設置できる。データを機器のハードドライブに保存することができ、解析実行中に機器の画面に表示できる。さらに、全ファイルを付属のUSBスティックに保存することができ、PyroMark Q24 Advanced Softwareをインストールしたコンピューターであればデータを解析できるという柔軟性がある。|PyroMark Q24 Vacuum Workstationは、PCR産物をパイロシークエンシング用の一本鎖DNAに変換する。PCR増幅産物を一連の至適化済み溶液により変性・洗浄する。この過程はわずか数分で24サンプル同時に行なえる。|