QuantiTect Probe PCR Kits
配列特異的なプローブを用いたリアルタイムPCRおよび2ステップRT-PCR用
- 低コピーターゲットの高感度な検出
- テンプレートの数段階の対数希釈範囲で正確な定量
- 殆どのリアルタイムサイクラー上で、殆どの配列特異的なプローブに対応
- UNG (uracil-N-glycosylase) 添付あるいは未添付のキットを選択可能
- 反応およびサイクリング条件の至適化不要
QuantiTect Probe PCR Kitsは配列特異的なプローブを用いてリアルタイムPCRおよび2ステップリアルタイムRT-PCRで高感度にgDNAおよびcDNAターゲットを定量します。ホットスタートと即使用可能なマスターミックス中の独自のPCRバッファーシステムの組み合わせは、至適化なしにほとんどのサイクラーで高感度なqRT-PCRを実現します。dNTP MixはdUTP を含み、オプションのUNG処理ができます。マスターミックスは2~8 ℃で保存でき、簡便に取り扱えます。
fr-BE
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Product
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Cat. no.
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List price:
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QuantiTect Probe PCR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 2 x 2 ml RNase-Free Water
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204343
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QuantiTect Probe PCR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 20 ml RNase-Free Water
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204345
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QuantiTect Probe PCR +UNG Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix, 100 ul UNG Solution, 2 x 2 ml RNase-Free Water
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204363
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QuantiTect Probe PCR Kits are intended for molecular biology applications. These products are not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.
Effective UNG digestion.|Two-step RT-PCR.|Highly specific amplification.|Wide dynamic range in two-step PCR.|Wide dynamic range in real-time PCR.|High sensitivity and efficiency, and wide dynamic range.|Specific primer annealing.|
106 copies of two dUMP-containing PCR amplicons were treated with or without UNG and then amplified by real-time PCR. UNG was from various suppliers, and real-time PCR was performed using the master mix from the QuantiTect Probe PCR +UNG Kit. ΔCT on the Y-axis indicates CT values for non-UNG-treated samples subtracted from CT values for UNG-treated samples. The UNG supplied with the QuantiTect Kit provided the greatest ΔCT (9-12 cycles). This indicates that QIAGEN UNG digests carryover PCR products more effectively than UNG from other suppliers.|The QuantiTect Probe PCR Kit overcomes the need for optimization of reaction conditions, which can be tedious and time-consuming. Simply add primers, probe, and cDNA template to the ready-to-use PCR master mix, and start the reaction on any real-time cycler (see also the table "Components of 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix").|In comparison with other DNA polymerases, only HotStarTaq DNA Polymerase in combination with a unique buffer specifically amplified a 497 bp fragment (from 50 copies of an HIV-pol-gene construct in a background of 1 µg human genomic DNA). M: Markers.|Duplicate reactions were performed on the Mx3005P using tenfold dilutions of human keukocyte cDNA (10 ng to 0.01 ng) and a TaqMan assay for IL1R2 (a cytokine). The QuantiTect Probe PCR Kit provided accurate gene expression analysis from low to high template amounts with a PCR efficiency of 101%.|Probe-based real-time PCR with UNG pretreatment was carried out using the QuantiTect Probe PCR +UNG Kit. Reactions were run in duplicate on the ABI PRISM 7900 using 10-fold dilutions of human leukocyte cDNA (100 ng to 10 pg) and a TaqMan assay for IL8 (a cytokine). The amplification plots were evenly spaced, leading to a high PCR efficiency of 94%.|Tenfold serial dilutions of leukocyte cDNA (100 ng to 1 pg) were analyzed in duplicate on the Mx3005 using the QuantiTect Probe PCR Kit with primers and a FAM-labeled probe specific for IL8 (interleukin 8). A PCR efficiency of 97% over 6 logs of template dilution was achieved, and as little as 1 pg of IL8 transcript was sensitively detected.|
A balanced combination of KCl and (NH4)2SO4 promotes specific annealing of primers and probes to the PCR template. K+ binds to phosphate groups on double-stranded DNA, stabilizing annealing of primers and probes. NH4+ destabilizes weak hydrogen bonds between mismatched bases.
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Performance
QuantiTect Probe PCR KitはQuantiTect Reverse Transcription Kitと組み合わせて、感度と信頼性の高い結果を実現します(図“幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現”)。QuantiTect Probe PCR Kitに添付のユニークなPCRバッファー成分はまた、低コピー数のDNAターゲットを高感度で定量し、広範囲にわたり直線性のある正確な定量を実現します (図 “幅広いダイナミックレンジにわたり効率的で感度の高い定量を実現”および“広範なダイナミックレンジを持つ2 ステップ RT-PCR”)。HotStarTaq DNA Polymeraseは他のポリメラーゼと比べて非常に厳密なホットスタートを実現することによりPCR反応の特異性がさらに増加します(図“特異性の高い増幅”)。 PCR コンタミの主要な原因は、その実験以前に行なったPCR 反応で増幅されたPCR 産物のキャリーオーバーです。PCR 開始前にUNG で前処理することにより、PCR 増幅産物のコンタミは分解され、続いて行なうPCR に影響を与えません。QuantiTect Probe PCR +UNG Kit に添付の特別に至適化されたUNG 溶液と実証済みのPCR マスターミックスの組み合わせは、PCR 産物のキャリーオーバーを効果的に回避し、ターゲット配列の定量が確実に行なえます(図“効果的なUNG前処理”および“幅広いダイナミックレンジをもつリアルタイムPCR”)。
Principle
QuantiTect Probe PCR Kit には、配列特異的なプローブを用いてゲノムDNAあるいはcDNAターゲットのリアルタイム定量を高感度で正確に行うために、至適化済みの即使用可能なマスターミックスが添付されています。本キットは、TaqMan あるいはその他のダブル標識プローブ、FRETプローブ、Molecular Beacons などのほとんどのタイプの配列特異的プローブを使用するためにデザインされています。QuantiTect Probe PCR Kit に添付のユニークなバッファーのK+/NH4+イオン配合比により、プライマーとプローブが核酸テンプレートに効率的かつ安定してアニーリングし、高いPCR効率を実現します(図 “特異的なプライマーアニーリング”)。さらに、バッファーには他のポリメラーゼと比べて非常に厳密なホットスタートを実現するHotStarTaq DNA Polymeraseが入っています。
QuantiTect Probe PCR Master MixはまたdUTPを含み、PCR 開始前にUNG(uracil-N-glycosylase)で前処理することにより、PCR 増幅産物のコンタミは分解され、続いて行なうPCR に影響を与えません。
| HotStarTaq DNA Polymerase |
95℃、15分の活性化 |
室温での定量PCRのセットアップ |
| QuantiTect Probe PCR Buffer |
NH4+とK+イオンの配合バランス |
特異性の高いプライマーのアニーリングで信頼性の高いPCR結果 |
| dNTPミックス |
一部dTTPの代わりにdUTPを含むので、PCR産物にコンタミが予想される場合、オプションのUNG処理が可能 |
PCR産物のキャリーオーバーによるコンタミをオプションのUNG処理で除去 |
| ROX 色素 |
Applied Biosystems およびAgilent製装置での蛍光シグナルを補正 |
ROX色素が必要なサイクラーで正確な定量。他のリアルタイムサイクラーでの反応を妨害しない |
Procedure
QuantiTect Probe PCR Kit を用いると、手間と時間のかかる反応条件の至適化を行なう必要がありません。プライマー、プローブ、DNAテンプレートを即使用可能なPCRマスターミックスに添加するだけで、反応を開始することができます(フローチャート “2ステップRT-PCR”)。ハンドブックに記載されているプロトコールに従うだけで、ほとんどのリアルタイムサイクラーで迅速かつ正確な結果が得られます。必要に応じて、前の反応液からのPCR 産物の混入を防ぐために、反応液をuracil-N-glycosylase(UNG)で前処理することができます。
2ステップリアルタイムRT-PCRで良好な結果を得るためには、QuantiTect Reverse Transcription Kitを用いてcDNAを合成することをお薦めします。ゲノムDNAの除去を組み合わせて、わずか20分で迅速なcDNA合成を実現します。
Applications
QuantiTect Probe PCR Kitsはプローブを利用したcDNAターゲットの遺伝子発現解析あるいはgDNAの定量解析をほとんどのサーマルサイクラーで行なえます。これには、Applied Biosystems およびBio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilent 製サイクラーを含みます。Rotor-Gene Q および他のRotor-Gene サイクラーを使用する場合は、これらの高速サイクリング用に開発されたRotor-Gene Probe PCR Kitの使用をお勧めします。
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Feature
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Specifications
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Applications
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Real-time quantification of DNA, cDNA, or RNA targets
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Reaction type
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PCR and two-step RT-PCR
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Real-time or endpoint
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Real-time
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Sample/target type
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DNA, cDNA, RNA
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Single or multiplex
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Single
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SYBR Green I or sequence-specific probes
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Sequence-specific probes
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Thermal cycler
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Most real-time cyclers (e.g. LC, RG, ABI)
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With or without ROX
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With ROX
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For use with QuantiTect PCR Kits to eliminate carryover of PCR products
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Show details
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For quantitative, real-time PCR and two-step RT-PCR using sequence-specific probes
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Show details
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Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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View
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Images
Effective UNG digestion.
106 copies of two dUMP-containing PCR amplicons were treated with or without UNG and then amplified by real-time PCR. UNG was from various suppliers, and real-time PCR was performed using the master mix from the QuantiTect Probe PCR +UNG Kit. ΔCT on the Y-axis indicates CT values for non-UNG-treated samples subtracted from CT values for UNG-treated samples. The UNG supplied with the QuantiTect Kit provided the greatest ΔCT (9-12 cycles). This indicates that QIAGEN UNG digests carryover PCR products more effectively than UNG from other suppliers.
Two-step RT-PCR.
The QuantiTect Probe PCR Kit overcomes the need for optimization of reaction conditions, which can be tedious and time-consuming. Simply add primers, probe, and cDNA template to the ready-to-use PCR master mix, and start the reaction on any real-time cycler (see also the table "Components of 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix").
Highly specific amplification.
In comparison with other DNA polymerases, only HotStarTaq DNA Polymerase in combination with a unique buffer specifically amplified a 497 bp fragment (from 50 copies of an HIV-pol-gene construct in a background of 1 µg human genomic DNA). M: Markers.
Wide dynamic range in two-step PCR.
Duplicate reactions were performed on the Mx3005P using tenfold dilutions of human keukocyte cDNA (10 ng to 0.01 ng) and a TaqMan assay for IL1R2 (a cytokine). The QuantiTect Probe PCR Kit provided accurate gene expression analysis from low to high template amounts with a PCR efficiency of 101%.
Wide dynamic range in real-time PCR.
Probe-based real-time PCR with UNG pretreatment was carried out using the QuantiTect Probe PCR +UNG Kit. Reactions were run in duplicate on the ABI PRISM 7900 using 10-fold dilutions of human leukocyte cDNA (100 ng to 10 pg) and a TaqMan assay for IL8 (a cytokine). The amplification plots were evenly spaced, leading to a high PCR efficiency of 94%.
High sensitivity and efficiency, and wide dynamic range.
Tenfold serial dilutions of leukocyte cDNA (100 ng to 1 pg) were analyzed in duplicate on the Mx3005 using the QuantiTect Probe PCR Kit with primers and a FAM-labeled probe specific for IL8 (interleukin 8). A PCR efficiency of 97% over 6 logs of template dilution was achieved, and as little as 1 pg of IL8 transcript was sensitively detected.
Specific primer annealing.
A balanced combination of KCl and (NH4)2SO4 promotes specific annealing of primers and probes to the PCR template. K+ binds to phosphate groups on double-stranded DNA, stabilizing annealing of primers and probes. NH4+ destabilizes weak hydrogen bonds between mismatched bases.
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