ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織切片からゲノムDNA とトータルRNA (small RNAを含む)の同時精製
- 最小限のサンプルから最大限の結果を実現
- 品質を損なうことなく DNAとRNA を遊離
- DNA と RNA を効果的に分離
- 同一 FFPE サンプルにおいて DNA/RNAを包括的に解析
ゲノムおよび転写産物のデータを正確に比較するためには、同一サンプルからDNAとRNAを精製することが不可欠です。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは特許申請中の溶解法を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片からDNAおよびRNAを精製します。精製された核酸はリアルタイムPCRおよびパイロシークエンスなどのアプリケーションに最適です。
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Product
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List price:
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AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (50)
50 RNeasy MinElute Spin Columns, 50 QIAamp MinElute Spin Columns, Collection Tubes, RNase-Free Reagents, and Buffers
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80234
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The AllPrep DNA/RNA FFPE Kit is intended for molecular biology applications. This product is not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.
Purification of DNA and RNA from FFPE samples.|Array analysis following preamplification of cDNA targets.|Reliable amplification of DNA and RNA from FFPE samples.|AllPrep DNARNA FFPE procedure.|
[A] Genomic DNA was purified from various FFPE rat tissues that were stored at room temperature for the times indicated. Purification was performed using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (a dedicated kit for DNA purification from FFPE samples) both including RNase digestion. DNA yields from 20 μm sections of each sample were determined by absorbance measurement. [B] RNA was purified from various FFPE rat tissues that were stored at room temperature for the times indicated. Purification was performed using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, the RNeasy FFPE Kit (a dedicated kit for RNA purification from FFPE samples). RNA yields from 10 μm sections of each sample were determined by absorbance measurement. The AllPrep Kit performed just as well as the dedicated DNA/RNA purification kits in recovering DNA/RNA from FFPE samples.|Total RNA was purified from human breast FFPE tissue using the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit. RNA was then reverse-transcribed using RT2 FFPE PreAMP technology. Gene expression analysis by real-time PCR was performed using the Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array, comparing a tumor sample to a nontumor sample. ΔΔCT analysis shows the x-fold difference in gene expression of tumor sample compared to nontumor sample.|[A] DNA and [B], [C] RNA were purified from various FFPE rat tissues using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, dedicated kits for DNA or RNA purification from FFPE samples (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit or RNeasy FFPE Kit). Real-time PCR or real-time RT-PCR was carried out on an ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System using [A] the QuantiTect SYBR® Green PCR Kit to analyze a 78 bp amplicon of the Prnp gene or [B], [C] the QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit to analyze Jun oncogene expression. The AllPrep Kit and the dedicated kits provided comparable CT values, indicating that all kits achieved similar efficiency in recovering usable DNA or RNA. [C] In addition, analysis of Jun expression was carried out without reverse transcriptase (-RT). The amplification plot for the spleen sample, a DNA-rich tissue, indicated the virtual absence of genomic DNA contamination.||
Principle
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit は、FFPE組織切片からのゲノムDNA とトータルRNAの同時精製用に特別にデザインされています。生体サンプルを分割する必要があるほかの精製法とは異なり、本法ではサンプルを分割せずに高純度DNAおよびRNAが得られます。DNAおよびRNAを別々に精製するためにサンプルを分割すると、性質の異なる可能性のある細胞集団からDNAおよびRNAを精製することになります。また、FFPEサンプルは貴重かつ回収が困難で、量が限られているために、同一サンプルからのDNAおよびRNAの精製はサンプルの浪費を回避することができます。
固定と包埋条件のために、通常FFPEサンプル中の核酸は著しく断片化され、新鮮あるいは凍結したサンプルから得られた核酸よりも分子量が低くなることが頻繁にあります。同一のFFPEサンプルからのDNAおよびRNAを分離する際の大きな問題は、断片化DNAが短く、部分的に一本鎖であり、インタクトなDNAよりもRNAに類似していることです。この断片化DNAの特性のためにDNAおよびRNAの物理的な分離は困難です。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、特許申請中の溶解法により同一FFPEサンプルからDNAとRNAを別々に遊離できます。
またFFPEサンプル中の核酸はホルムアルデヒドにより化学的に修飾されます。ホルムアルデヒドによるクロスリンクはゲル電気泳動やラボオンチップ解析などの通常の品質管理アッセイでは検出されませんが、酵素的な解析を強く阻害します。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、DNAやRNAを分解することなくホルムアルデヒドによるクロスリンクを切断するように最適化されています。
Procedure
同一のFFPE組織切片サンプルから高品質なDNAおよびRNAを簡単な操作手順で精製できます(フローチャート“ AllPrep DNA/RNA FFPE 操作手順”)。AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、特許申請中の溶解法により同一FFPEサンプルからDNAとRNAを別々に遊離できます。この方法では、FFPEサンプルを至適化済みの溶解バッファーとインキュベートすることで、RNAが遊離しDNAは沈殿します。遠心操作後、RNAを含む上清とDNAを含むペレットは別々の操作により精製されます。さらにインキュベーションにより部分的にクロスリンクは切断され、その後RNeasy MinElute Spin ColumnあるいはQIAamp MinElute Spin Columnを用いてRNAあるいはDNAを精製します。精製RNAに関しては、カラム上でのDNase処理によりコンタミしたDNAを効率的に除去します。RNAの結合条件によって、miRNAなどのsmall RNAを含むRNA、または含まないRNAの精製が可能です。スピンカラム処理を行なう前にDNAとRNAは既に分離されているため、精製されたDNAのRNAコンタミは最小限に抑えられていますが、オプションでカラム上でのRNase処理を行なうこともできます。
Applications
AllPrep DNA/RNA FFPE Kitは、DNAやRNAを分解することなくホルムアルデヒドによるクロスリンクを切断するように最適化されています。 しかしFFPEサンプルから精製した核酸は、高分子のDNAや完全長RNAを必要とするダウンストリームアッセイには推奨されません。いくつかのアプリケーションでは断片化した核酸を使用できるように実験を変更する必要があります(例えばPCRやRT-PCRで短い増幅産物が得られるようにプライマーをデザイン)。cDNA合成にはoligo-dTプライマーの代わりに遺伝子特異的なプライマーの使用を推奨しています。遺伝子特異的なプライマーの使用が不可能な場合は、ランダムプライマーを使用します。
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Sample to Insight solutions for successful molecular analysis
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Critical factors for molecular analysis of FFPE samples
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High-quality, nucleic acid purification for successful PCR and NGS experiments.
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Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
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View
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Images
Purification of DNA and RNA from FFPE samples.
[A] Genomic DNA was purified from various FFPE rat tissues that were stored at room temperature for the times indicated. Purification was performed using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (a dedicated kit for DNA purification from FFPE samples) both including RNase digestion. DNA yields from 20 μm sections of each sample were determined by absorbance measurement. [B] RNA was purified from various FFPE rat tissues that were stored at room temperature for the times indicated. Purification was performed using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, the RNeasy FFPE Kit (a dedicated kit for RNA purification from FFPE samples). RNA yields from 10 μm sections of each sample were determined by absorbance measurement. The AllPrep Kit performed just as well as the dedicated DNA/RNA purification kits in recovering DNA/RNA from FFPE samples.
Array analysis following preamplification of cDNA targets.
Total RNA was purified from human breast FFPE tissue using the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit. RNA was then reverse-transcribed using RT2 FFPE PreAMP technology. Gene expression analysis by real-time PCR was performed using the Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array, comparing a tumor sample to a nontumor sample. ΔΔCT analysis shows the x-fold difference in gene expression of tumor sample compared to nontumor sample.
Reliable amplification of DNA and RNA from FFPE samples.
[A] DNA and [B], [C] RNA were purified from various FFPE rat tissues using either the AllPrep DNA/RNA FFPE Kit or, as a control, dedicated kits for DNA or RNA purification from FFPE samples (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit or RNeasy FFPE Kit). Real-time PCR or real-time RT-PCR was carried out on an ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System using [A] the QuantiTect SYBR® Green PCR Kit to analyze a 78 bp amplicon of the Prnp gene or [B], [C] the QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit to analyze Jun oncogene expression. The AllPrep Kit and the dedicated kits provided comparable CT values, indicating that all kits achieved similar efficiency in recovering usable DNA or RNA. [C] In addition, analysis of Jun expression was carried out without reverse transcriptase (-RT). The amplification plot for the spleen sample, a DNA-rich tissue, indicated the virtual absence of genomic DNA contamination.
AllPrep DNARNA FFPE procedure.
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