miScript Target Protectors

miRNAとターゲット間の相互作用を阻害してmiRNA機能を研究

  • miRNA 研究のための新規ツール
  • miRNAによる制御実験に即トランスフェクション可能
  • mRNA上の特定のmiRNA結合部位をプロテクトし精密な機能研究を促進
  • ヒト、マウス、ラットのターゲットに対応する配列をカスタムデザイン
miScript Target Protector は一本鎖の修飾RNA で、miRNA が標的とするmRNA 上の特定結合部位をプロテクトすることで、miRNA とそのターゲットとの相互作用のみを特異的に阻害します。 一方、同一miRNA の他のターゲットの制御には影響を与えません。miScript Target Protector のトランスフェクション後に行なう表現型や遺伝子発現の解析は、特定のmiRNAの標的遺伝子の同定や、その機能の解明に有用です。
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製品名 Cat. no. List price:
miScript Target Protector
5 nmol cell-culture–grade target protector
 Varies
Details
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miScript Target Protectors は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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信頼できるmiRNA阻害効果|ターゲットの検証|目的遺伝子に特異的なmiScript Target Protector|BCL-2に対するmiRNA制御の阻害|miScript Target Protectorトランスフェクション後の表現型の変化|
miR-16はHeLa S3細胞およびMCF-7細胞内で発現している。miR-16との結合部位をもつルシフェラーゼレポーターコンストラクトおよび同じ結合部位をプロテクトするmiScript Target Protectorを様々な量で一緒にトランスフェクトした。全ての量において、miRNAによる抑制が阻害されルシフェラーゼの発現が顕著に増加した。Neg. control:ルシフェラーゼコンストラクトとNegative Control miScript Target Protectorのコトランスフェクション。Unregulated:miR-16結合部位をもたないルシフェラーゼコンストラクト。Attractene Transfection Reagentをコトランスフェクションに使用した。|MCF-7 細胞にmiR-29a miScript miRNA Mimic (10 nM)と Negative Control miScript Target Protectorをコトランスフェクト(Mimic)、あるいはmiR-29a miScript miRNA Mimic とmiScript Target Protector（DNMT3A のmiR-29aが結合すると推定された部位をプロテクト、1 µM）をコトランスフェクト（Mimic + target protector） した。トランスフェクションにはHiPerFect Transfection Reagentを使用した。48時間後に、DNMT3Aの発現解析をリアルタイムRT-PCRで行なった。トランスフェクトしていない細胞も解析した。Negative control: AllStars Negative Control siRNA とNegative Control miScript Target Protectorのトランスフェクション。|miR-1はADARおよびHDAC4遺伝子発現を抑制する。ADAR のmiR-1結合部位に対応するmiScript Target Protector（1 µM、0.5 µM、0.1 µM、0.05 µM） とmiR-1 miScript miRNA Mimic (10 nM)をHeLa細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションにはHiPerFect Transfection Reagentを使用した。72時間後にウエスタンブロットによりADAR（左側）ならびにHDAC4（右側） の発現を検出した。インターナルコントロールとしてTubulinを検出した。トランスフェクトしていない細胞（untransfected）も解析した (UT)。ネガティブコントロール(Neg.):Negative Control miScript Target Protector と miR-1 miScript miRNA Mimic のコトランスフェクション。ADAR のmiR-1結合部位をプロテクトするmiScript Target Protectorは、ADARのmiR-1による発現抑制を阻害したが、miR-1によるHDAC4の発現抑制には影響を与えなかった。|BCL-2 のmiR-15a/miR-16 結合部位に対応するmiScript Target Protector(500 nMあるいは1 µM) とmiR-16 miScript miRNA Mimic (10 nM)をMCF-7細胞にコトランスフェクトした。72時間後にウエスタンブロットによりBCL-2発現を検出した。MimicとTarget Protectorをコトランスフェクトした細胞は、ネガティブコントロールに比較して発現量が増大した。ネガティブコントロール(Neg.):miR-16 miScript miRNA MimicとNegative Control miScript Target Protectorのコトランスフェクション。インターナルコントロールとしてTublinも検出した。トランスフェクションにはHiPerFect Transfection Reagentを使用した。|MCF-7細胞にmiR-9 miScript miRNA Mimic（10 nM）をトランスフェクト、あるいはmiR-9 miScript miRNA Mimic（10 nM）とmiScript Target Protector （細胞生存関連遺伝子のmiR-9 結合部位をプロテクト、1 µM）をコトランスフェトした。72時間後に、細胞生存を光学顕微鏡で観察した。トランスフェクションにはHiPerFect Transfection Reagentを使用した。|
パフォーマンス
特定のターゲット部位をプロテクトするmiRNAの特異的阻害

miScript Target Protectorはその配列と修飾によって、目的のmiRNA結合部位を特異的かつ効率的にプロテクトします。ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いた実験では、miScript Target Protectorのトランスフェクション後、信頼性および再現性の高いmiRNA阻害効果が得られました（図“信頼できるmiRNA阻害効果”）。miScript Target Protectorは特定のターゲット遺伝子のmiRNA結合部位をプロテクトしますが、同じmiRNAが結合する他の遺伝子には影響しないことが観察されました（図“目的遺伝子に特異的なmiScript Target Protector”）。

miRNAターゲット予測の信頼できる検証

miScript Target Protectorを用いて、ある遺伝子が特定のmiRNAによって制御されていることを証明できます。DNMT3A遺伝子は、発生と分化に関与するDNA methyltransferase 3をコードしています。TargetScanで、DNMT3Aの3' UTRにmiR-29aに対する一つの結合部位を予測しました。miR-29a miScript miRNA mimicのトランスフェクションはリアルタイムRT-PCRで示されるようにDNMT3Aの発現低下を引き起こし、 miR-29aが転写レベルで DNMT3Aを発現抑制することを示唆しています。TargetScan により予測されたmiR-29a 結合部位に対してデザインしたmiScript Target Protector をトランスフェクションした結果、DNMT3A 発現が増加しました。これらの実験は、TargetScanにより予測された結合部位を介してmiR-29aがDNMT3Aを抑制しているエビデンスになります（図“ターゲットの検証”）。

タンパク質レベルで確認されたmiRNA制御

遺伝子発現は転写レベルおよびタンパク質レベルでmiRNAにより抑制されます。miScript Target Protectorは両レベルでmiRNA制御を阻害します。Human BCL-2 はmiR-15a とmiR-16 の2 種類の内因性miRNA により制御されることが知られています。miR-15aとmiR-16は、いずれもBCL-2の3' UTR にある同じ部位に結合します。この部位に対するmiScript Target Protectorのトランスフェクションにより、タンパク質レベルでBCL-2発現が増加しました（図“BCL-2に対するmiRNA制御の阻害”）。

miRNA制御による表現型への影響

miRNA が細胞のプロセスあるいはパスウェイに及ぼす影響は、細胞形態や細胞生存率の変化など表現型の変化として現れます。miScript Target Protector のトランスフェクション後に観察される表現型の変化は、miRNAと目的のターゲットがパスウェイ／プロセスで重要な役割を果たすことを示唆しています。miR-9は、ある細胞生存率に重要な遺伝子の発現抑制を引き起こします。MCF-7細胞へのmiR-9 miScript miRNA Mimicのトランスフェクションにより高レベルで細胞死が観察されました。しかし、遺伝子のmir-9結合部位に対してデザインされたmiScript Target ProtectorとmiR-9 miScript miRNA Mimicのコトランスフェクションでは細胞死は観察されませんでした。この結果は、miScript Target ProtectorがmiR-9による抑制効果を阻害し、細胞生存に重要な遺伝子が発現したことを示唆しています（図 “miScript Target Protectorトランスフェクション後の表現型の変化”）。

原理

miScript Target Protectorは個々の遺伝子の制御におけるmiRNAの役割を究明するための新規の ツールです。miScript Target Protector はターゲット遺伝子における特定のmiRNA結合部位をプロテクトするようにデザインされています。トランスフェクション後、miScript Target ProtectorはmRNA上のmiRNA結合部位に結合し、この部位へのmiRNAのアクセスをブロックし、特定のmiRNA による遺伝子のダウンレギュレーションを阻害します。

操作手順
miScript Target Protectorのトランスフェクション後に表現型あるいは遺伝子発現の解析を行ないます。標的遺伝子の発現増大、シグナル伝達パターンの変化、表現型の変化は、miRNAとその標的遺伝子が研究対象のパスウェイあるいは表現型に関与している証明になります。様々なパスウェイにおけるmiRNAの役割は、異なるmiScript Target Protectorのトランスフェクション後の特定の表現型を調べることにより研究できます。

QIAGEN のmiRNA機能解析用製品には、合成miRNAである miScript miRNA Mimics、全ターゲット上の特定のmiRNA作用を阻害するmiScript miRNA Inhibitorsもあります。miScript miRNA Mimic およびInhibitor をmiScript Target Protector とともに使用してmiRNA 機能を詳細に洞察することが可能です。

ポジティブおよびネガティブコントロール

実験セットアップと結果解析を容易に行なうためにPositiveおよびNegative Control miScript Target Protectorも入手可能です。Negative Control miScript Target Protector は、既知の哺乳動物遺伝子と相同性がありません。Positive Control miScript Target Protectorは内因性BCL-2をmiR-15aおよびmiR-16からプロテクトするようにデザインされています。Positive Control miScript Target Protectorのトランスフェクションは、実験セットアップが適切であるかどうかを決定するポジティブコントロールになります。

アプリケーション

miScript Target ProtectorはmiScript miRNA MimicsとInhibitorsを組み合わせて以下のような広範なmiRNA機能研究に使用できます：

miRNA結合部位の検証
パスウェイあるいはプロセスにおけるmiRNAの役割同定
目的遺伝子の制御研究
マイクロアレイ解析などの実験結果の確証
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Feature
Specifications
Design Customer design
Format Single tubes
Scale or yield 5 nmol
Sequence provided No
Species Human, mouse, rat

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MSDS
1
Safety Data Sheets
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安全データシート
1
MSDS miScript Target Protector

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