QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits

配列特異的なプローブを用いた遺伝子発現解析用1 ステップマルチプレックスリアルタイムRT-PCR

  • 至適化が不要なマルチプレックス解析
  • 1 反応で複数のターゲットを解析可能
  • わずか10 コピーのターゲットも高感度で検出
  • ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子を確実に定量
  • リファレンス遺伝子と3種類までのターゲットを同一チューブ内で検出可能

QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitは、1ステップのマルチプレックスリアルタイムRT-PCRにより1反応で最高5種類のRNAターゲットを正確に定量します。ホットスタートと即使用可能なマスターミックス中の独自のPCRバッファーシステムの組み合わせは、至適化なしにほとんどのリアルタイムサイクラーで高感度で確実なマルチプレックスqRT-PCRを実現します。dNTP MixはdUTPを含み、オプションのUNG処理ができます。2種類のキットが入手できます：蛍光補正のためにROXが必要なサイクラー用QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitおよびその他のサイクラー用のQuantiTect Multiplex RT-PCR NoROX Kit。マスターミックスは2～8 ℃で保存でき、簡便に取り扱えます。

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製品名 Cat. no. List price:
QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mix (with ROX dye), 100 µl QuantiTect Multiplex RT Mix, 2 x 2 ml RNase-Free Water
 204643
¥102,000
QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mix (with ROX dye), 0.5 ml QuantiTect Multiplex RT Mix, 20 ml RNase-Free Water
 204645
¥427,000
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR NoROX Master Mix (without ROX dye), 100 µl QuantiTect Multiplex RT Mix, 2 x 2 ml RNase-Free Water
 204843
¥102,000
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Multiplex RT-PCR NoROX Master Mix (without ROX dye), 0.5 ml QuantiTect Multiplex RT Mix, 20 ml RNase-Free Water
 204845
¥427,000
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QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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Triplex PCR とsingleplex PCR で同等の増幅|Duplex PCR で10 コピーまでのターゲットRNA を検出（Applied Biosystems 7500）- 様々な量のターゲットRNA（FAM）|4plex PCR およびSingle PCR で同等の増幅|QIAGEN multiplex kits|ユニークなPCRバッファー|
QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit およびTaqMan プローブを用いてApplied Biosystems 7500 で1ステップのtriplex リアルタイムRT-PCR を行なった。テンプレートはバーキットリンパ腫細胞株Ramos から得たトータルRNA 20 ng を使用した。反応はtriplicateで行なった。28S rRNAをHEX標識プローブで検出した。POLD3（DNAポリメラーゼδ3のアクセサリーサブユニット）をFAM標識プローブで検出した。CDK2（細胞周期依存性キナーゼ2）をCyanine 670標識プローブで検出した。ターゲットを1ステップのsingleplex リアルタイムRT-PCR でも定量し、結果を比較検討した（黒線）。Triplex PCRとsingleplex PCRの曲線は重なり、同等の増幅であることが示唆された（すなわち同等のCT値）。|QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit とTaqMan プローブを用いてApplied Biosystems 7500 上でDuplex リアルタイムRT-PCRを1ステップで行なった。ターゲットRNA は、ウイルス遺伝子のin vitro 転写物の1,000、100、10 コピー（[A]）で、各溶液に合成インターナルコントロールRNA 1,000 コピー（[B]）を添加した。反応を繰り返し行なった。ターゲットRNA はFAM 標識プローブで検出した。インターナルコントロールはHEX 標識プローブで検出した。10 コピーのターゲットRNA は7 回の繰り返し実験で再現性良く検出された。|QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit およびTaqMan プローブを用いてLightCycler 2.0 で1ステップの4plex リアルタイムRT-PCR を行なった。K562 細胞から得られたトータルRNA 10、1、0.1 ng をテンプレートとして用いた。[A] c-myc（がん原遺伝子）をFAM 標識プローブで検出した。[B] GAPDH（グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素）をHEX標識プローブで検出した。[C] HSP89（熱ショックタンパク質）をTexas Red標識プローブで検出した。[D] H28S（28S rRNA）をAlexa Fluor 660標識プローブで検出した。ターゲットを1ステップのsingleplexリアルタイムRT-PCRでも定量し、結果を比較検討した（黒線）。4plex PCR とsingle PCR の曲線は重なり、同等の増幅であることが示唆される（すなわち同等のCT値）。|QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitは、簡単な操作でマルチプレックスリアルタイムRT-PCRを実現する。汎用されている方法に比べて、本キットはプライマー、プローブ、Mg2+、Taq DNA polymeraseの濃度に対する至適化が不要で、リファレンス遺伝子に比べてターゲット遺伝子のコピー数が少ないアッセイでも同様。|[A] NH4+ イオンは非特異的なプライマーのテンプレートへのアニーリングを防ぐ。[B]画期的なPCR添加物であるFactor MP は、テンプレート周辺でのプライマー濃度を高める。K+ や他の陽イオンと共に、Factor MPは特異的に結合したプライマーを安定化し、HotStarTaq DNA Polymeraseによる効果的なプライマーエクステンションを可能にする。|
パフォーマンス

QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitはわずか10コピーのターゲットRNAを高い感度で検出しました（図"Duplex PCR で10 コピーまでのターゲットRNA を検出"）。スタートコピー数が最高100,000倍も異なるような転写物を4-plexアッセイで定量した結果、良好な結果が得られました（図"4plex PCR およびSingle PCR で同等の増幅"）。

遺伝子発現の相対定量は、同一ウェルあるいはチューブ中でターゲット遺伝子と内因性コントロール遺伝子の発現を定量することにより、正確に行なえます。QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitを用いて行なったマルチプレックス反応で得られたターゲットのCT値は、ターゲットの増幅を別々の反応で行なったコントロール実験で得られたCT値と同等の結果が得られました（図"Triplex PCR とSingle PCR で同等の増幅"）。このことは異なるターゲットが同一のマルチプレックス反応液中で同じ効率と感度で増幅され、互いが増幅反応を妨害しないことを証明しました。

原理

遺伝子発現の相対定量は、同一ウェルあるいはチューブ中でターゲット遺伝子と内因性コントロール遺伝子の発現を定量することにより、正確に行なえます。QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitは1ステップのマルチプレックスRT-PCRで初回実験から良好な結果が得られます（図"QIAGEN Multiplex Kits"）。至適化したマスターミックスを使用することで、マルチプレックス反応のPCR産物は、対応する単一増幅反応のPCR産物と同じ効率および感度で確実に増幅されます。標的遺伝子のコピーが10個もあれば、本キットで検出することができます。

別々の反応ではなく同一反応内でリファレンス遺伝子と標的遺伝子を増幅することで、マニュアルでの作業によるエラーが最小限に抑えられ、遺伝子定量の信頼性が高くなります。QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mixに入っている画期的な合成添加剤Factor MPとK+およびNH4+のイオン配合比により、プライマーとプローブが核酸テンプレートに効率的かつ安定にアニーリングし、高いPCR効率を実現します（図 "ユニークなPCRバッファー"）。さらに、HotStarTaq DNA Polymeraseが、厳密なホットスタートを実現して非特異的産物の形成を防ぐ一方で、逆転写酵素の最適なブレンドが、様々な量のRNA テンプレートからcDNAを合成することを可能にします。

QuantiTect Multiplex RT-PCR Master MixもdUTPを含んでいるので、uracil-N-glycosylase（UNG）による前処理をPCR開始前に行なうことができます。従って、混入しているPCR産物がその後のPCR反応に影響を与えることはありません。

2x QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitの成分
成分 特長 利点
HotStarTaq DNA Polymerase 95℃、15分の活性化 室温での定量PCRのセットアップ
QuantiTect Multiplex RT-PCR Buffer NH4+ イオンとK+ イオンの配合バランス 特異性の高いプライマーのアニーリングで信頼性の高いPCR結果
合成添加剤Factor MP 同一チューブで4遺伝子まで信頼できるマルチプレックス解析が可能
dNTP Mix 一部dTTPの代わりにdUTPを含むので、PCR産物にコンタミが予想される場合、オプションのUNG処理が可能 PCR産物のキャリーオーバーによるコンタミをオプションのUNG処理により除去
ROX 色素* Applied Biosystems およびAgilent製装置での蛍光シグナルを補正 ROXが必要なサイクラーで正確な定量。他のリアルタイムサイクラーでの反応を妨害しない
Omniscript Reverse TranscriptaseおよびSensiscript Reverse Transcriptase RNAに対する高い親和性を有する酵素の特別なブレンド 複雑な二次構造のRNAでも転写可能
* ROX色素はマスターミックスに添加済みあるいは未添加。表"QuantiTect Multiplex PCR Kitの選択"を参照。
操作手順

QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitsは、反応条件やサイクリング条件の至適化が不要な、即使用可能なマスターミックスです。ハンドブックに記載されたプロトコールは1種類のみで、市販のほとんどのリアルタイム用サーマルサイクラーと推奨する色素で使用可能です。必要に応じて、前の反応液からのPCR産物の混入を防ぐために、反応液をuracil-N-glycosylase（UNG）で前処理することができます。

マスターミックス中にROX パッシブリファレンス色素が添付されているキットもしくは添付されていないキットを選択することで、ほぼ全ての市販のリアルタイムサイクラーで使用することができます（表参照）。ROX濃度が至適化されているため、コピー数が少ない場合の検出でも自動データ解析を行なえます。

QuantiTect Multiplex RT-PCR Kitの選択ガイド
ROX 色素 キット 対応するサイクラー
マスターミックスに添加済み QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits Applied Biosystems社のサイクラー
マスターミックスに入っていない QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits Rotor-Geneサイクラー、およびBio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilentなどのメーカーのサイクラー
アプリケーション

QuantiTect Multiplex RT-PCR KitはRNAターゲットの遺伝子発現解析をほとんどのサーマルサイクラーで行なえます。これには、Applied Biosystems およびBio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilent 製サイクラーを含みます。Rotor-Gene Q および他のRotor-Gene サイクラーを使用する場合は、これらの高速サイクリング用に開発されたRotor-Gene Multiplex RT-PCR Kitの使用をお勧めします。

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Feature
Specifications
Applications Real-time quantification of RNA targets in a multiplex format
Description For quantitative, multiplex, real-time one-step RT-PCR using sequence-specific probes
Reaction type Real-time one-step RT-PCR
Real-time or endpoint Real-time
Sample/target type RNA targets
Single or multiplex Multiplex
SYBR Green I or sequence-specific probes Sequence-specific probes
Thermal cycler Real-time cyclers dedicated for multiplex PCR (e.g., most Applied Biosystems real-time cyclers, Roche LightCycler 480, and Bio-Rad iCycler iQ)
With or without ROX With ROX or without

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キットハンドブック
2
(JA) - QuantiTect Multiplex RT-PCRプロトコールとトラブルシューティング
QuantiTect Multiplex PCR Kit - ROX passive reference
dyeを含むマスターミックス添付
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit — ROX passive reference dyeを含まないマスターミックス添付
配列特異的なプローブを用いた1ステップのマルチプレックス・リアルタイム定量RT-PCRによる遺伝子発現解析
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(EN) - QuantiTect Multiplex RT-PCR Handbook
QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit - with master mix containing ROX passive reference dye QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit - with master mix free of ROX passive reference dye For gene expression analysis by quantitative, multiplex, real-time one-step RT-PCR using sequence-specific probes
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テクニカルインフォメーション
1
Overcoming the challenges of real-time, multiplex PCR - (EN)

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MSDS
2
Safety Data Sheets
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