QuantiTect Multiplex PCR Kits

cDNAテンプレートの希釈液（100 ng、11.11 ng、1.23 ng、0.14 ng）をiCycler iQ上でtriplex PCR（カラーの曲線）およびsingleplex PCR（グレーの曲線）により解析した。FAM、HEX、Cyanine 670色素で標識したTaqManプローブを用いた（データ提供：University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA）。|QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kitを用いて、GAPDH、18S、HSP、H28S配列を4-plex PCRあるいはsingleplex PCRでRotor-Gene 3000システム上で増幅した。テンプレートはヒト白血球cDNA 100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ngを用いた。反応はtriplicateで行なった。FAM、HEX、Texas Red、Cyanine 670色素で標識したTaqManプローブを用いた。4-plex PCR およびsingleplex PCRデータを同じ増幅プロット上に示し、singleplex PCRの曲線はグレーで表した。増幅ブロットは様々なテンプレート量で信頼できるマルチプレックス定量を示し、triplicatesの各結果も再現性のあることを示した。GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、18S：18S rRNA、HSP：熱ショックタンパク質、H28S：28S rRNA。|QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kitを用いて、3種類の配列（CSBG、GAPDH、HSP）をtriplex PCRあるいはsingleplex PCRでLightCycler 2.0システム上で増幅した。ヒトゲノムDNA（CSBG増幅用）、直鎖状プラスミド（GAPDH増幅用）、ヒト白血球cDNA（HSP増幅用）の3種類のテンプレートミックスを様々な量で調製した。反応はduplicateで行なった。FAM、HEX、Texas Red色素で標識したTaqManプローブを用いた。増幅プロットは、triplex PCRでCSBGの検出を示している（青色：1400コピー、緑色：140コピー、赤色：14コピー）。|[A] QuantiTect Multiplex PCR KitまたはSupplier A_IIのキットを用いてDuplex PCRをABI PRISM 7700上で行なった。様々な量のt（8;14）転座配列（50,000、5000、500、50、10コピー）を一定量のGAPDH（グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）配列（10⁷コピー）と一緒に増幅した。FAM標識TaqManプローブを用いてRamos細胞株のゲノムDNAからt（8;14）転座配列を増幅した。HEX標識TaqManプローブを用いて、GAPDH cDNA配列を含むプラスミドからGAPDH配列を増幅した。Supplier A_IIのキットと比較し、QuantiTect Multiplex PCR Kitでは、GAPDH配列が高コピー数（10⁷コピー）存在する状況下で、t（8;14）転座配列が高コピー数でも低コピー数（最低10コピー、矢印で示す）でも、信頼できる定量結果が得られる。[B] [A]に記載されている調製法を繰り返したが、標的配列はsingleplex PCRで個々に増幅した。|QuantiTect Multiplex PCR Kitは、簡単な操作でマルチプレックスリアルタイムRT-PCRを実現する。汎用されている方法に比べて、本キットはプライマー、プローブ、Mg²⁺、Taq DNA polymeraseの濃度に対する至適化が不要で、リファレンス遺伝子に比べてターゲット遺伝子のコピー数が少ないアッセイでも同様。|[A] NH₄⁺ イオンは非特異的なプライマーのテンプレートへのアニーリングを防ぐ。[B]画期的なPCR添加物であるFactor MP は、テンプレート周辺でのプライマー濃度を高める。K⁺ や他の陽イオンと共に、Factor MPは特異的に結合したプライマーを安定化し、HotStarTaq DNA Polymeraseによる効果的なプライマーエクステンションを可能にする。|