dPCR Microbial DNA Detection Assay

微生物の同定およびプロファイリングは、人間の健康、食品および飼料の検査や環境検査など、多くの分野で注目されています。微生物の同定は、サンプル内の微生物の存在の有無を判断しますが、一方で微生物のプロファイリングでは2つ以上の実験条件下における相対的な発現を判断するため、リファレンスサンプルと正規化が必要になります。

弊社のdPCR Microbial DNA Detection Assayは細菌、真菌、寄生虫、ウイルス、抗生物質耐性または毒性因子遺伝子をターゲットとします。細菌の場合、アッセイは16S rRNA遺伝子をターゲットとし、真菌の場合はリボソームRNA遺伝子をターゲットとします。ポートフォリオは700を超えるアッセイから構成され、そのうち200はウェットラボ検証されたdPCRです。弊社のプレデザイン微生物dPCRアッセイのポートフォリオに含まれていないターゲットについては、細菌、真菌、ウイルスターゲット用の使いやすいカスタムアッセイ設計ツールを提供しています。

各アッセイは、プライマーペアと設定可能な蛍光色素を使った加水分解プローブで構成されています。利用可能な蛍光色素には、FAM、HEX、ROX、TAMRA、Cy5およびATTO700があり、1回のマルチプレックスdPCR反応で最大12種類の異なるターゲットの解析に対応するように組み合わせることもできます。また、一般的な対象のターゲットの解析用にウェットラボで検証されたdPCR 5プレックスアッセイバンドルも提供しています。詳細については、以下のアプリケーションを参照してください。dPCR反応では、アッセイがQIAcuity Probe PCR Kit（DNAターゲット）またはQIAcuity OneStep Advanced Probe Kit（RNAターゲット）またはQIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit（1回の反応でターゲットが5個を超える場合）と組み合わせられます。

本アッセイは、QIAcuity Digital PCR SystemおよびQIAcuity Nanoplatesと併せて機能します。

製品について詳しくお知りになりたい場合は、弊社のdPCRスペシャリストより連絡を差し上げますので、こちらからサインインしてください。

正確で精密な検出

dPCR Microbial DNA Detection AssayおよびQIAcuity dPCR Systemにより、正確なデジタルPCRベースの定量が可能です。NISTリファレンス物質の解析では、インプットのテンプレートに予想される濃度が示されています。詳細については、図Shigella sonneiのQuantification of the NIST reference standard 8376 using the gDNAを参照してください。

マルチプレックスでの性能

マルチプレックスdPCRベースの微生物ターゲット検出では、より少ない反応数で小規模なパネルを柔軟に設定できるため、貴重なサンプルを節約できます。マルチプレックス化では必要なナノプレートウェル数が減り、1回のランで解析可能なサンプル数が増加するため、解析スループットも向上します。弊社のdPCR Microbial DNA Detection Assayは、マルチプレックス解析のために組み合わせて使用することが可能です。

異なる色素（FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy5、ATTO700）を使用したシングルアッセイを注文することで、独自のアッセイを組み合わせてマルチプレクシング用アッセイとして組むことができます。または、弊社の科学者によってdPCRを用いた実実験で検証済みの5-plexアッセイバンドルからお選びいただくことも可能です。700種類以上の既成アッセイのその他の組み合わせについては、ご自身の研究室で検証を行ってください。

dPCR Microbial DNA Detection Assayを使ったシングルプレックスとマルチプレックス解析の比較では、あらゆるターゲットに対して同等で高精度の定量が示されています。正確なターゲット定量に加えて、12プレックスdPCRランもさまざまな水媒介性微生物病原体の非常に特異的な検出も示されています。

あらかじめ設計されたMicrobial DNA Detection Assaysおよびカスタム dPCR Microbial Assayは、ナノプレートデジタルPCRでの使用を目的としています。各アッセイは、対象となる微生物の種特異的な遺伝領域または個々の微生物遺伝子の領域に対するエンドポイントPCR増幅に基づいています。 増幅産物は、ターゲット特異的な蛍光加水分解プローブを使って検出され、アッセイの特異性が向上します。

細菌種を検出するdPCR Microbial DNA Detection Assayは、リボソームRNA遺伝子–主に16SリボソームRNA遺伝子–をターゲットとしており、16S配列とNCBIに登録された基準株DNA配列のGreenGenesデータベースを使用して設計されました。真菌、ウイルス、後生動物種のアッセイは、それぞれNCBIに登録されたリボソームRNA遺伝子や他の個別のマーカー遺伝子など、異なるターゲット特異的な遺伝領域をターゲットとしています。抗生物質耐性遺伝子のアッセイの設計にはlahey.org、ARDBなど、また毒性因子遺伝子のアッセイの設計にはVFDBなど、さまざまなデータベースが使用されました。

カスタム dPCR Microbial Assayは、微生物ターゲット用に特別に開発され、高度かつ十分に検証されたアルゴリズムに基づく弊社のカスタムアッセイ設計ソフトウェアを用いて作成されています。これにより、各アッセイ設計が厳格な性能基準を確実に満たすことが保証され、最適な感度と特異性を備えた堅牢で高品質のアッセイが実現できます。

ナノプレートでのdPCR反応の原理はこちらで説明しています。

dPCR Microbial DNA Detection AssayおよびCustom dPCR Microbial Assayプロトコールはシンプルであり、 QIAcuity dPCR装置を備えたあらゆるラボで実施できます。サンプルからDNAを単離し、即使用可能なQIAcuity Probe MastermixとMicrobial DNA-Free Water（UCP水）に添加します。プライマーと加水分解プローブのセットが含まれているこの混合液を、dPCRプレプレートの各ウェルに分注します。反応混合液はプレプレートから dPCR Nanoplateのウェルに搬送され、その後密封されてQIAcuity dPCR装置に載せられます（図シンプルかつ迅速なプレートベースのワークフローを参照）。パーティショニング、サイクリング、イメージングステップは、プレセットされたパラメーターに従い、QIAcuity dPCR装置が全自動で行います。サイクリングプロトコールによりますが、2時間程度でdPCRランの結果をQIAcuity Software Suiteで解析できることもあります（図最小限のハンズオンタイムで約2時間で完了する微生物dPCRを参照）。

dPCR Microbial DNA Detection Assayは、細菌、真菌、ウイルスの各種の検出および微生物抗生物質耐性や毒性因子遺伝子の検出に最適で、糞便、喀痰、膣スワブ、下水などのさまざまなサンプルを解析できます。

さらに、Custom dPCR Microbialアッセイ設計ツールを使用すれば、弊社のプレデザインdPCR Microbial DNA Detection Assayが取り扱っていない、目的のターゲットのあらゆる微生物（細菌、真菌、ウイルス）ターゲットのアッセイをシームレスに設計できます。

dPCRウェットラボ検証済みの5プレックスバンドル

* F：FAM、H：HEX、T：TAMRA、R：ROXまたはC：Cy5