miRCURY LNA miRNA PCR Assays

• 比類のない感度は、わずか1 pgの全RNAからのmiRNA定量化を可能にします
• 血清/血漿、FFPE切片およびLCMサンプルなど、RNA収量の低いサンプルでも最適
• 高い特異性により、前駆体からのmiRNAおよび成熟miRNAを見分ける
• 迅速で簡単な2ステッププロトコールにより、結果まで3時間未満
• miRBaseをすべてカバーするため、任意の生物からmiRNAプロファイリングが可能

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、miRCURY LNA miRNA PCR Systemを用いて非常に高感度で特異的なmiRNA定量を可能にする個別のmiRNA PCRプライマーセットです。フォワード・リバースのプライマーは、いずれもmiRNA特異的でLNA技術により最適化されています。アッセイは、チューブまたはプレートあたり200反応で、チューブまたはプレート形式で利用できます。

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比類のない検出感度

miRCURY LNA miRNA PCRアッセイの優れた感度は、T_m値を均一化したLNA技術によるプライマーと単一条件による逆転写反応の組み合わせによってもたらされています。この組み合わせにより、最初の1本鎖cDNA合成でわずか1pgのtotal RNA inputから個々のmiRNAを正確かつ信頼性のある定量を実現しました（Accurate quantitation from down to 1 pg total RNA starting material 参照）。 

ステムループ型や標準のDNAプライマーを使用したこれまでmiRNAリアルタイムPCRシステムと比較して、LNAプライマーを使用すると、感度が大幅に向上します。特にATリッチなmiRNAの場合は顕著です（LNA-enhanced primers result in greatly increased sensitivity compared to DNA primers 参照）。

LCMサンプルや血清/血漿などの難しいサンプルから精製された全RNAを使用したmiRNA定量なども、本製品の検出感度があれば問題ありません（Detection of differential expression of miRNAs in LCM specimens from FFPE tissue sections および Differences in miRNA expression between serum samples 参照）。 

検証と最適化済み

すべての実際のサンプルで検証されたmiRCURY LNA miRNA PCRアッセイは、検出感度が最大になるように最適化されています。アッセイの80％以上がPCR反応で少なくとも5つのmiRNAコピーを検出します（Serial dilution of hsa-miR-181a 参照）。また、プライマーセットは標的の特異的増幅および最小限のバックグラウンドシグナルについても有効性が確認されている（Specific and sensitive amplification of miRNA 参照）。 

特異性の高いプラットフォーム

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、高い特異性（miRQC study published in Nature Methods参照）を持つ唯一のmiRNA定量プラットフォームです。そして他のプローブベースのmiRNA qPCRプラットフォームで実施した特異性テストをはるかに上回る結果でした（miRQC study published in Nature Methods 参照）。優れた特異性は、偽陽性を排除し、信頼性の高いmiRNAシグナルのみを検出します。

優れた識別能

フォワードおよびリバースPCR増幅プライマーの両方にLNAを組み込むことで、1塩基のみが異なるmiRNA配列を識別するアッセイが設計可能になりました（Single-nucleotide discrimination 参照）。 さらに、このアッセイは、成熟miRNA配列と前駆体miRNAとを区別することも可能です。 

迅速、簡単　そして再現性も

使いやすい3時間プロトコールは、実験室での時間と労力を節約します。すべてのPCR反応にテンプレートとして同じcDNAを使用することにより、この手順は従来のmiRNA特異的cDNA合成を必要とするシステムと比較して大幅に簡素化されます。数回のピペット操作のために操作上の誤差も最小化することができます。結果として、日々の結果や、施設間での結果も再現性良く比較することができます。 

miRCURY LNA miRNA PCR Assayは、miRCURY LNA RT KitおよびmiRCURY LNA SYBR Green PCR Kitの使用に最適化されています。他の試薬を使用すると、結果に影響することがあります。

miRNAプロファイリングのための独自のシステム

miRCURY LNA miRNA PCR Assaysは、単一条件による逆転写反応とLNA PCR増幅を組み合わせることで、miRNAリアルタイムPCR市場における高い水準の性能と使いやすさを両立しました（Schematic outline of the miRCURY LNA miRNA PCR System 参照）。単一条件による逆転写反応により、複数のmiRNAリアルタイムPCRアッセイのテンプレートを一度のcDNA合成反応でまかなえます。これは貴重なサンプルを節約し、技術的なバリエーションを削減し、実験室での時間を節約します。さらに、フォワードおよびリバースプライマーはmiRNAに特異的であり、LNA技術で最適化されています。これは、1）優れた感度と非常に低いバックグラウンドを提供し、非常に低いmiRNAレベルの正確な定量化、および2）非常に近似したmiRNA配列同士の識別を可能にする特異的アッセイを提供することを意味します。

カバレッジ

miRBase 20のすべての生物を対象とした20,000を超えるアッセイが利用可能です。1,400以上のアッセイは、合成生物サンプルや生物サンプルで感度、特異性、効率、バックグラウンドの検証がされています。 その他のアッセイは、高品質、種特異的そして各生物種で最適な感度と特異性を示すような包括的なアルゴリズムにより、 in silico での検証がなされています。これは、同じターゲットでも、生物種ごとにいくつかの異なるアッセイ配列があることを意味します。最終的に、各生物種のアッセイは、生物の遺伝的背景に基づいて選択されます。 NGS実験などから新規miRNAで作業している場合は、任意のLNA miRNAプライマーセットをカスタム設計することもできます。

標準化のためのリファレンス遺伝子アッセイ

9種類のリファレンス遺伝子プライマーセットが用意されており、さまざまなサンプルタイプから高品質のデータ標準化と信頼性の高いデータを生成できます（下記表参照）。これらのコントロールプライマーは、異なるヒト組織で構成的および比較的安定に発現する内在性の小さなノンコーディングRNAをターゲットとしています（Expression levels of reference genes in different human tissues 参照）。これらコントロールのリファレンス遺伝子は、広い範囲のCq値をカバーするため、幅広いmiRNA発現レベルを正確かつ確実に標準化することができます。

コントロールプライマーセットは、miRCURY LNA miRNA PCR Systemのリファレンス遺伝子として検証され、miRCURY LNA RT KitおよびmiRCURY LNA SYBR Green PCR Kitで最適です。リファレンスとして選択する前に、すべての実験において、遺伝子の一貫性や発現の恒常性を常に確認することは非常に重要です。多数のリファレンス遺伝子の検証や、GeNormやNormFinderなどのソフトウェアを使用して、リファレンス遺伝子を選択することをお勧めします。

miRCURY LNA miRNA PCR AssaysはmiRCURY LNA miRNA PCR Systemの一部として使用されます：

1. 成熟miRNAの定量
2. snoRNAの検出