EpiTect MethyLight PCR Kits

メチル化状態のリアルタイム定量プローブ法によるPCR解析

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EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit (200)

Cat. No. / ID:   59496

Master Mix without ROX for methylation-specific real-time PCR analysis, 200 x 50 µl reactions
¥86,500
EpiTect MethyLight PCR Kitsは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

  • 高精度なTaqManプローブ法によるリアルタイム解析
  • MethyLight Assayを用いて確実なメチル化定量
  • 簡便なマスターミックスフォーマット

製品詳細

EpiTect MethyLight PCR Kit およびEpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kitは、TaqManプローブあるいはダブル標識プローブによりメチル化部位を判別し、高感度で信頼できる定量を実現します。キットは即使用可能で、至適化は必要ありません。本キットは様々なリアルタイムサイクラー上で使用できます。EpiTect MethyLight PCR KitはApplied Biosystems 7500 を除く全てのApplied Biosystems 社製のサイクラーに適しています。EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit は、AppliedBiosystems 7500、Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Roche、Stratagene製装置を含むほとんどのサイクラーに対応しています。

パフォーマンス

EpiTect MethyLight PCR Kitは、EpiTect MethyLight Assaysのようなダブル標識アッセイと組み合わせることで、DNAメチル化状態の少しの変化をも鋭敏に検出できます(図 " 高感度リアルタイムPCR定量")。
図参照

原理

EpiTect MethyLight PCR Kitsは、EpiTect MethyLight Assaysや他のダブル標識アッセイと組み合わせて使用でき、Bisulfite処理したDNAの高感度定量が可能です。配列判別のレベルに応じて、MethyLight解析は定量あるいはセミ定量フォーマットで行なわれます。 

TaqManプローブなどのダブル標識プローブは、蛍光団およびクエンチャーを有する配列特異的なオリゴヌクレオチドです。蛍光団はプローブの5'末端に、クエンチャーは内部または3'末端に付加されています。PCRのエクステンション中に、ポリメラーゼの 5'→3' エキソヌクレアーゼ 活性によりプローブは分解され、蛍光団はクエンチャー色素から分離します。この結果PCR 産物の蓄積量に比例した蛍光シグナルが検出されます。

メチル化特異的プローブを用いたQuantitative MethyLight リアルタイムPCR

MethyLight PCRを用いた定量的メチル化解析では、異なる蛍光標識の2つのダブル標識プローブをPCRプライマーセットと組み合わせて使用します。Bisulfite処理したDNAでは、メチル化CpG部位および非メチル化CpG部位に対して異なるプローブ配列が必要です。プライマーは非メチル化部位に特異的なものです。このプローブの一方は目的の部位のメチル化DNAに特異的に結合し、もう一方は同部位の非メチル化DNAに特異的に結合します。プローブは異なる蛍光団を含んでいるので、メチル化配列と非メチル化配列の量を測定できます(図 " MethyLight リアルタイム定量PCR")。

メチル化特異的プライマーを用いたSemiquantitative MethyLight リアルタイムPCR

MethyLight PCRを用いたセミ定量的メチル化解析では、ダブル標識プローブを目的のメチル化部位に特異的に結合するPCRプライマーセットと組み合わせて使用します。Bisulfite処理したDNAでは、メチル化CpG部位および非メチル化CpG部位に対して異なるプローブ配列が必要であり、このプライマーはBisulfite処理したDNAのメチル化部位に特異的な配列になっています。 メチル化特異的なプライマーがDNAに結合すると伸長し、Taq DNA Polymeraseの 5'→3' エキソヌクレアーゼ活性がプライマーを分解し、蛍光団を放出します。蛍光団がクエンチャーから切り離される際に蛍光が検出可能になります(図 " MethyLight リアルタイムセミ定量PCR")。

特異性の増加

EpiTect MethyLight Master Mixは、配列特異的なプローブを用いたメチル化および非メチル化DNAの高感度検出用に特別に開発されました。PCRバッファーには様々な塩類や添加物に加えて、特別に最適化された割合でKClと(NH4)2SO4を含んでいるため、各PCRサイクルのアニーリングステップでの非特異的なプライマーとプローブの結合に対し、特異的な結合の比率を増大します。これによりプローブの選択的なハイブリダイゼーションが形成され、非メチル化/メチル化のターゲット配列を検出することができます。厳密なプライマーアニーリング条件によりBisulfite変換DNAを増幅する際のPCR特異性が増大し、プローブ法によるメチル化検出の信頼性が増します。

MethyLight PCRのコントロール反応

MethyLight PCR プローブおよびプライマーがメチル化DNAおよび非メチル化DNAに特異的に結合しているかを確認するためには、コントロール反応を行なわねばなりません。そのような反応の際には、種々の濃度のbisulfite変換コントロールDNA(完全にメチル化されているDNAと完全な非メチル化DNA)が必要となります。さらにこれらのControl DNAのミックスが、メチル化率を定量する際のスタンダードとなります。QIAGENのEpiTect Control DNA Setは、コントロール反応に必要な品質管理されたDNA — bisulfite変換メチル化DNA、bisulfite変換非メチル化DNA、正常ヒトゲノムDNA — が含まれており、信頼性の高い標準的なメチル化特異的コントロール反応に直ちに使用できるキットフォーマットです。

図参照

操作手順

EpiTect MethyLight PCR Kitは迅速かつ簡便に反応セットアップができるマスターミックスフォーマットを採用しています。マスターミックスにROX含有のキットと含有されていないキットの2種類があり、様々なリアルタイムサイクラーで使用可能です。プロトコールはほとんどのリアルタイムサイクラーで最適な結果が得られることが検証済みです。

EpiTect MethyLight PCR Kitには、ROX passive reference dye含有マスターミックスが添付されており、蛍光補正のために高濃度のROX色素を必要とするリアルタイムサイクラーでの使用に適しています(例、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systemsを除くApplied Biosystems製の機器)。

EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial KitのマスターミックスにはROX色素は含まれていませんが、別個にROX溶液が添付されており、使用するリアルタイムサイクラーにより反応に加えることができます。このキットは、蛍光補正に低濃度のROX色素を必要とするサイクラー(例、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems)、オプションでROX色素を使用するサイクラー(例、Stratagene製の機器)、およびROX dyeを必要としないサイクラーに向いています。

エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー

エピジェネティクス情報を得ることは生物学や医学研究における多くの分野(特に、腫瘍学や幹細胞研究、および発生生物学)にとって最も重要です。しかし、DNA メチル化における変化の解析は、サンプル(特に非常に限られた量のサンプル)から再現性のあるデータを得るための標準化された方法がないために非常に困難です。QIAGENが新しく紹介するEpiTectソリューションにより、DNAサンプル採取、安定化、精製からBisulfite処理、リアルタイムPCRやエンドポイントPCR、メチル化解析、シークエンシングまで、標準化されたプレアナリティカル用製品および解析用製品を提供致します。(図 " エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー")。

図参照

アプリケーション

EpiTect MethyLight PCR Kit は定量およびセミ定量のリアルタイムPCR解析に最適で、EpiTect MethyLight Assayやその他の2種類の標識プローブを利用したアッセイと組み合わせて使用できます。

裏付けデータと数値

Specifications

FeaturesSpecifications
ApplicationsQuantification of bisulfite converted DNA
Reaction typeHighly accurate and sensitive probe-based MethyLight real-time analysis
Real-time or endpointReal-time
With or without ROXAvailable with ROX in master mix and with ROX as separate vial
Sample/target typeBisulfite converted DNA
SYBR Green I or sequence-specific probessequence-specific probes
Single or multiplexSingle & duplex
Thermal cyclerMost real-time cyclers except Applied Biosystems 7500 systems

リソース

キットハンドブック (1)
EpiTect MethyLight PCR Kit
EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit
For quantitative methylation analysis using
sequence-specific probe-based real-time PCR
パンフレット (2)
Now with even more applications!
MSDS (1)
Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.
Safety Data Sheets (1)
Certificates of Analysis (1)
Brochures & Guides (2)
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Kit Handbooks (1)
EpiTect MethyLight PCR Kit
EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit
For quantitative methylation analysis using
sequence-specific probe-based real-time PCR

FAQ

What is the advantage of EpiTect MethyLight PCR Kits over QuantiTect Probe PCR Kits for methylation studies?

The EpiTect MethyLight PCR Kit chemistry is especially developed for the requirements of bisulfite converted DNA. As a result of methylation and the conversion of unmethylated cytosines through bisulfite treatment, probe hybridization behavior differs from that of untreated DNA, and requires special buffer conditions. The balanced cations as well as Factor MP in the MethyLight PCR chemistry are contributing to the special hybridization behavior required for bisulfite converted DNA.

 

 

FAQ ID -2010
Can the EpiTect PCR Control DNAs also be used as standard in real-time methylation specific quantification?

Yes, the EpiTect Control DNA and Control DNA Set can be used as standards in real-time methylation specific quantification. For data, please see our EpiTect MethyLight PCR Product Profile.

 

 

 

FAQ ID -2006
What happens when using EpiTect MethyLight Assays on only partially bisulfite converted DNA template?

If only two of three CpG sites are methylated in the template DNA, EpiTect MethyLight Assays used with the EpiTect MethyLight PCR Kit will detect the site as methylated, irrespective of conversion success for the third CpG site.

However, if only one of three CpG sites is methylated, and the remaining two unmethylated C residues fail to convert to U after bisulfite treatment, the EpiTect MethyLight System will detect the unmethylated site as methylated. Therefore we strongly recommend to use our EpiTect Bisulfite Kits to achieve 100% conversion rate.

 

 

FAQ ID -2009
How long can DNA converted with EpiTect Bisulfite Kits be stored before use in methylation specific PCR with the EpiTect MSP Kit?

We have data for DNA converted with EpiTect Bisulfite Kits showing that the bisulfite treated DNA is stable for 3 years at -20°C before use in methylation specific PCR with the EpiTect MSP Kit, or the EpiTect MethyLight PCR Kit.

 

 

FAQ ID -2002