PyroMark OneStep RT-PCR Kit

PyroMark OneStep RT-PCR Kitは、パイロシークエンス解析用のサンプル調製専用に至適化された初めてのRT-PCRキットです。本キットはどのようなRNAテンプレートでも容易で感度の高い1ステップRT-PCRを実現します。このRT-PCR産物は、ウイルス検出およびジェノタイピング、アレルに特異的な遺伝子発現解析、mRNAスプライシングアイソフォームの検出など多様なパイロシークエンス・アプリケーションに使用できます。最適な酵素の組み合わせと特別に開発された反応バッファーにより、効率的で特異性の高い逆転写反応とPCRを1本のチューブで行なえます。 至適化は不要です。キットに入っているQ-Solutionは複雑な二次構造をもつテンプレートやGC含有量の高いテンプレートを効率的に増幅し、CoralLoad Concentrateはゲルへのアプライを簡便化し、アガロースゲル上でRT-PCR産物を可視化します。

QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix

QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mixは逆転写反応とPCR増幅の二つの反応に特異的な酵素が最適な割合でブレンドされています。

Omniscript およびSensiscript Reverse Transcriptaseは、効率的で特異性の高い逆転写反応を実現します。両逆転写酵素ともにRNAに対して高いアフィニティーを持ち、他の逆転写酵素では困難な二次構造でも逆転写反応が可能です。Omniscript Reverse Transcriptaseは、は50 ng以上のRNA用に特別にデザインされ、Sensiscript Reverse Transcriptaseは微量RNA（<50 ng）用に至適化されています。この特別な酵素配合が、1 pgから2 μgまでのRNA量でも効率的で感度の高い逆転写反応を実現します。

HotStarTaq DNA Polymeraseは特異性の高い増幅を行なうホットスタートPCRを実現します。化学修飾されたHotStarTaq DNA Polymeraseは、逆転写反応中は不活性で逆転写反応を阻害しません。逆転写反応後、95℃で15分間のインキュベーションによりHotStarTaq DNA Polymeraseを活性化すると同時に逆転写酵素を不活化します。HotStarTaq DNA Polymeraseを用いたこのホットスタート工程は、非特異的にアニーリングしたプライマーやプライマーダイマーからの伸長反応を最初のステップで回避し、特異性と再現性の高いPCRを実現します。

QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer

QIAGEN OneStep RT-PCR Bufferは 効率的な逆転写反応と特異的な増幅を実現するようにデザインされています。本試薬は、最適なバッファー成分により高温度（50℃）での逆転写反応が可能です。この高い反応温度によって二次構造を壊すことで、逆転写酵素の効率を改善し、少量のRNAテンプレートを用いた1 ステップRT-PCR が可能となります。また、QIAGEN酵素と特殊な組成のバッファーとの組み合わせは1ステップRT-PCRで高いPCR効率も実現します。このバッファー組成は、従来のPCRバッファーに比べて広範なアニーリング温度とMg²⁺ 濃度において高い特異性でプライマーのアニーリングを実現させます。その結果、アニーリング温度やMg²⁺濃度を変動して行なうRT-PCRの至適化実験の必要性は最小限ですみます（図“プライマーアニーリングの特異性増大”）。

CoralLoad Concentrate

PyroMark OneStep RT-PCR Kitにはゲルローディング試薬と2種類のマーカー色素（オレンジと赤色）が含まれているCoralLoad Concentrateが入っています（図“CoralLoad Concentrate”）。CoralLoad Concentrateの存在下で増幅したRT-PCR産物はアガロースゲルに直接アプライできます。

Q-Solution

PyroMark OneStep RT-PCR Kitに入っているQ-Solutionは、核酸の変性環境を改善する画期的な添加剤です。Q-Solution はGCリッチなテンプレートや高度な二次構造を持つテンプレートの逆転写反応と増幅反応を促進します。

逆転写反応および PCR 反応は同一チューブ内で逐次的に行なわれます。両方の反応に必要な全ての成分は反応セットアップ中に添加するので、一旦反応を開始した後は何も添加する必要はあり ません。至適化されたサイクリング条件では30分の逆転写反応、その後HotStarTaq DNA Polymeraseを活性化し、続いてテンプレートの増幅を行ないます。

PyroMark OneStep RT-PCR Kitは特に以下のようなパイロシークエンス・アプリケーションに最適です：

• ウイルス検出
• ウイルスのジェのタイピング
• アレルに特異的な遺伝子発現解析
• mRNAスプライシング・アイソフォームの検出