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PAXgene Blood RNA kit

Pour l'extraction et la purification de l’ARN intracellulaire à partir sang stabilisé dans des tubes PAXgene Blood RNA

  • Conforme à la directive européenne IVD 98/79/CE
  • Système intégré pour le prélèvement, la stabilisation et la purification (1)
  • Stabilisation de l’ARN entre 18 et 25 °C pour une durée maximale de 3 jours (1)
  • Stabilisation à -20 ou -70 °C pendant au moins 60 mois (1)
  • Traitement standardisé des échantillons avant l’analyse (1)


Le système PAXgene Blood RNA se compose des tubes PAXgene Blood RNA (disponibles auprès de BD, n° de réf. 762165) pour le prélèvement, la stabilisation et le transport de sang, et du kit PAXgene Blood RNA pour l’isolement et la purification de l’ARN à partir d’une membrane de silice dans des colonnes de centrifugation. La purification peut être effectuée manuellement, par microcentrifugeuse ou de façon automatisée sur le QIAcube. Les tubes et kits conformes au marquage CE-IVD offrent des spécifications de performances exactes, assurant une purification très fiable de l’ARN. (1)

Cat No./ID: 762174
PAXgene Blood RNA Kit (50)
586,00 €
Order Product
50 colonnes PAXgene Spin, 50 colonnes PAXgene Shredder Spin, tubes de traitement, DNase I exempte de RNase, réactifs et tampons exempts de RNase. A utiliser en combinaison avec les tubes PAXgene Blood RNA.

Le PAXgene Blood RNA kit est destiné à un usage de diagnostic in vitro.


Le site web n’est pas disponible en français dans son intégralité. Son contenu est international et peut aller à l’encontre des règlementations locales.
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Reproductibilité et répétabilité de la purification d’ARN.
Des échantillons de sang en 4 exemplaires, prélevés sur 14 donneurs, ont été traités manuellement par chacun des 3 techniciens (A, B et C). Trois équipements ont été utilisés et tous les échantillons préparés par un même technicien ont été traités sur le même équipement.  [A] Les moyennes et écarts-types des rendements d’ARN par échantillons de réplicats des mêmes donneurs et de techniciens différents sont indiqués.  [B] Douze échantillons sanguins de réplicats ont été traités par les 3 techniciens différents pour chacun des 14 donneurs. Les moyennes et écarts-types des rendements d’ARN par échantillons des mêmes donneurs et de tous les techniciens sont indiqués. Pour les échantillons d’ARN, les rapports A260/A280 sont compris entre 1,8 et 2,2.
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Répétabilité et reproductibilité du rendement de l’ARN.
Les échantillons de sang de 30 donneurs différents ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (12 tubes par donneur, 360 tubes au total). Le contenu des tubes de 3 donneurs a été mis en pool puis réaliquoté en 36 échantillons. Ces 36 échantillons par pool de 3 donneurs ont été traités manuellement par 3 opérateurs différents. Chaque opérateur a utilisé 3 lots de kits PAXgene Blood RNA différents pour l’extraction et a traité des échantillons en 4 exemplaires de chacun des 10 pools de donneurs.  [A] Rendement d’ARN et écart-type pour chaque combinaison opérateur-lot. Les échantillons de sang en 4 exemplaires provenant de 10 pools de donneurs ont été traités par 3 opérateurs différents (A, B et C) avec chacun des 3 lots de kits (1, 2 et 3). Les rendements moyens (colonnes) et les écarts-types (barres d’erreur) sont présentés pour chaque échantillon en 4 exemplaires du même pool de donneurs pour des opérateurs et lots de kits différents.  [B] CV du rendement d’ARN par pool de donneur pour toutes les combinaisons opérateur-lot (A, B, C ; 1, 2, 3) calculé à partir du rendement moyen et de l’écart-type du rendement indiqués à la partie A.
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Procédure manuelle PAXgene Blood RNA.
La procédure PAXgene Blood RNA commence par une étape de centrifugation en culots d’acides nucléiques dans le tube PAXgene Blood RNA. Le culot est lavé et remis en suspension, puis l’ARN est purifié manuellement.
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Procédure automatisée PAXgene Blood RNA.
La procédure PAXgene Blood RNA commence par une étape de centrifugation en culots d’acides nucléiques dans le tube PAXgene Blood RNA. Le culot est lavé et remis en suspension, puis l’ARN est purifié automatiquement.
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Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : FOS.
Des échantillons de sang ont été prélevés sur 10 donneurs, en duplicats, et stockés à une température comprise entre 18 et 25 °C pendant la durée indiquée, avant la purification d’ARN total.  [A] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes PAXgene Blood RNA, et l’ARN total a été purifié avec le kit PAXgene Blood RNA.  [B] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes de prélèvement sanguin standard contenant de l’EDTA en tant qu’anticoagulant, et l’ARN total a été purifié au moyen d’une méthode d’extraction standard à base d’une solution organique avec lavage de l’ARN à base de membrane de silice. Les niveaux relatifs de transcripts de FOS ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique indiquant toutes les moyennes et tous les écarts-types. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale du test (2,34 CT).
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Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : IL1B.
Des échantillons de sang ont été prélevés sur 10 donneurs, en duplicats, et stockés à une température comprise entre 18 et 25 °C pendant la durée indiquée, avant la purification d’ARN total. [A] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes PAXgene Blood RNA, et l’ARN total a été purifié avec le kit PAXgene Blood RNA. [B] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes de prélèvement sanguin standard contenant de l’EDTA en tant qu’anticoagulant, et l’ARN total a été purifié au moyen d’une méthode d’extraction standard à base d’une solution organique avec lavage de l’ARN à base de membrane de silice. Les niveaux relatifs de transcripts IL1B ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique indiquant toutes les moyennes et tous les écarts-types. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale du test (1,93 CT).
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Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : IL1B.
Des échantillons de sang ont été prélevés sur 10 donneurs, en duplicats, et stockés à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant la durée indiquée, avant la purification d’ARN total. [A] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes PAXgene Blood RNA, et l’ARN total a été purifié avec le kit PAXgene Blood RNA. [B] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes de prélèvement sanguin standard contenant de l’EDTA en tant qu’anticoagulant, et l’ARN total a été purifié au moyen d’une méthode d’extraction standard à base d’une solution organique avec lavage de l’ARN à base de membrane de silice. Les niveaux relatifs de transcripts IL1B ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique indiquant toutes les moyennes et tous les écarts-types. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale du test (1,93 CT).
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Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : FOS.
Des échantillons de sang ont été prélevés sur 10 donneurs, en duplicats, et stockés à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant la durée indiquée, avant la purification d’ARN total.  [A] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes PAXgene Blood RNA, et l’ARN total a été purifié avec le kit PAXgene Blood RNA.  [B] Les échantillons de sang ont été prélevés et stockés dans des tubes de prélèvement sanguin standard contenant de l’EDTA en tant qu’anticoagulant, et l’ARN total a été purifié au moyen d’une méthode d’extraction standard à base d’une solution organique avec lavage de l’ARN à base de membrane de silice. Les niveaux relatifs de transcripts de FOS ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique indiquant toutes les moyennes et tous les écarts-types. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale du test (2,34 CT).
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Reproductibilité entre les utilisateurs.
Les échantillons de sang de 30 donneurs différents ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (12 tubes par donneur, 360 tubes au total). Le contenu des tubes de 3 donneurs a été mis en pool puis réaliquoté en 36 échantillons. Ces 36 échantillons par pool de 3 donneurs ont été traités manuellement par 3 opérateurs différents. Chaque opérateur a utilisé 3 lots de kits PAXgene Blood RNA différents pour l’extraction et a traité des échantillons en 4 exemplaires de chacun des 10 pools de donneurs. Les niveaux relatifs de transcripts de [A] FOS et [B] IL1B ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique par rapport aux valeurs pour l’utilisateur 1 (10 pools de donneurs x 3 lots de kits x 4 réplicats = 120 ensembles de données pour chaque gène), avec toutes les moyennes (lignes rouges) et écarts-types (barres bleues) des échantillons. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale des tests (FOS, 2,34 CT) ; IL1B, 1,93 CT).
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Reproductibilité entre les lots de kits.
Les échantillons de sang de 30 donneurs différents ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (12 tubes par donneur, 360 tubes au total). Le contenu des tubes de 3 donneurs a été mis en pool puis réaliquoté en 36 échantillons. Ces 36 échantillons par pool de 3 donneurs ont été traités manuellement par 3 opérateurs différents. Chaque opérateur a utilisé 3 lots de kits PAXgene Blood RNA différents pour l’extraction et a traité des échantillons en 4 exemplaires de chacun des 10 pools de donneurs. Les niveaux relatifs de transcripts de [A] FOS et [B] IL1B ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique par rapport aux valeurs pour le lot de kit 1 (10 pools de donneurs x 3 utilisateurs x 4 réplicats = 120 ensembles de données pour chaque gène), avec toutes les moyennes (lignes rouges) et écarts-types (barres bleues) des échantillons. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale des tests (FOS, 2,34 CT) ; IL1B, 1,93 CT).
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Reproductibilité entre les protocoles automatisé et manuel.
L’ARN a été purifié par 3 opérateurs différents (A, B, C) au moyen de 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA en protocole automatisé dans l’expérience décrite à la figure « Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique ». Parallèlement, l’ARN a été purifié à partir des tubes de réplicats correspondants en protocole manuel. Les niveaux relatifs de transcripts de [A] FOS et [B] IL1B ont été déterminés par RT-PCR duplex en temps réel, à l’aide d’ARNr 18S comme standard interne. Les différences possibles des niveaux de transcripts entre l’ARN préparé à partir d’échantillons de sang couplés au moyen des deux protocoles d’extraction (manuel et automatisé) ont été calculées selon la méthode ΔΔCT. Les valeurs ΔΔCT individuelles de chacune des paires d’échantillons (4 réplicats x 8 pools de donneurs x 3 lots de kits x 3 opérateurs = 288 paires pour chaque gène) sont indiquées dans un graphique en tant que points isolés accompagnés des moyennes (points plus gros) et des écarts-types (barres noires) pour tous les échantillons. Les lignes pointillées indiquent ±3x la précision totale du test (FOS, 2,34 CT ; IL1B, 1,93 CT).
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Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique.
Les échantillons de sang de 48 donneurs différents ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (6 tubes par donneur, 288 tubes au total). Le contenu des tubes de 6 donneurs a été mis en pool puis réaliquoté en 36 échantillons. Ces 36 échantillons par pool de 6 donneurs ont été traités par 3 opérateurs différents (A, B, C). Chaque opérateur a utilisé 3 lots de kits (1, 2, 3) PAXgene Blood RNA pour l’extraction automatisée et a traité des échantillons en 4 exemplaires de chacun des 8 pools de donneurs. Les rendements de l’ARN, les valeurs A260/A280 et les quantités d’ADN génomique (m/m) de chacun des échantillons sont indiqués pour toutes les combinaisons opérateur-lot.
Performance

Les tubes PAXgene Blood RNA sont destinés au prélèvement de sang total et à la stabilisation d’ARN intracellulaire pour une durée maximale de 3 jours à une température entre 18 et 25 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : IL1B ») ou jusqu’à 5 jours entre 2 et 8 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : IL1B »). Les données actuellement disponibles indiquent une stabilisation de l’ARN cellulaire pendant au moins 60 mois à -20 °C ou -70 °C.

L’ARN total purifié à l’aide du système PAXgene Blood RNA est très pur, avec des valeurs A260/A280 comprises entre 1,8 et 2,2 et un ADN génomique ≤ 1,0 % (m/m). Au moins 95 % des échantillons ne présentent aucune inhibition à la RT-PCR lorsque 30 % maximum de l’éluat est utilisé.
La durée moyenne de préparation des échantillons (à partir des données de 12 préparations d’échantillons) est d’environ 90 minutes, dont seulement 40 minutes de manipulation. Le rendement d’ARN prélevé sur 2,5 ml de sang total humain est ≥ 3 µg pour ≥ 95 % des échantillons traités. Les rendements dépendent fortement du donneur. Les rendements individuels peuvent donc varier. Pour les donneurs individuels, le système PAXgene Blood RNA offre des rendements hautement reproductibles et répétables (voir figures « Reproductibilité et répétabilité de la purification d’ARN » et « Répétabilité et reproductibilité du rendement de l’ARN ») et une RT-PCR reproductible et répétable (voir figures « Reproductibilité entre utilisateurs » et « Reproductibilité entre lots de kits », et le tableau correspondant), ce qui le rend très robuste pour les tests de diagnostic clinique.

Le rendement d’ARN prélevé sur 2,5 ml de sang total humain est ≥ 3 µg pour ≥ 95 % des échantillons traités. La figure « Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique » indique les rendements d’ARN sur un total de 288 échantillons préparés en protocole automatisé avec 3 lots de kits et 3 opérateurs. Étant donné que des échantillons sanguins en pool ont été utilisés à la place des tubes individuels PAXgene Blood RNA pour ces études, les résultats ne reflètent pas le rendement d’ARN attendu à partir d’échantillons individuels de prélèvement sanguin. Les rendements dépendent fortement du donneur. Les rendements individuels peuvent donc varier.

Au moins 95 % des échantillons ne présentent aucune inhibition à la RT-PCR lorsque 30 % maximum de l’éluat est utilisé. En protocole automatisé, la contamination croisée entre les échantillons est indétectable, comme le mesure la RT-PCR quantitative en temps réel pour les séquences de bêta-globine et les transcripts FOS dans les échantillons négatifs en ARN (eau) couplés à des échantillons positifs en ARN (sang total humain) lors de la même analyse.

L’ARN purifié avec le système PAXgene Blood RNA et le protocole automatisé est très pur, comme l’indique l’absence d’inhibition à la RT-PCR (voir ci-dessus) et les valeurs A260/A280 comprises entre 1,8 et 2,2. L’ADN génomique est présent à ≤ 1 % (m/m) dans ≥ 95 % des échantillons, comme le mesure la PCR quantitative en temps réel d’une séquence du gène de la bêta-actine. La figure « Rendement et pureté de l’ARN - traitement automatique » indique les valeurs A260/A280 et l’ADN génomique relatif d’un total de 288 échantillons préparés en protocole automatisé avec 3 lots de kits et 3 opérateurs. 

Le protocole automatisé de la purification d’ARN au moyen du système PAXgene Blood RNA offre des résultats de RT-PCR hautement reproductibles et répétables, comme indiqué à la figure « Reproductibilité entre les protocoles automatisé et manuel », ce qui le rend très robuste pour les tests de diagnostic clinique.

Résumé des données de RT-PCR
Système de test  Test FOS/18S rRNA  Test IL1B/18S rRNA
Comparaison des données  Moy.  ± É.T.  Moy. ± É.T.
 (ΔΔCT)  (ΔΔCT)  (ΔΔCT) (ΔΔCT)
 Reproductibilité pour chacun des utilisateurs et entre tous les lots 
 Tous les utilisateurs, lot 1 - lot 1  0,00  0,00  0,00  0,00
 Tous les utilisateurs, lot 1 - lot 2  -0,03  0,48  -0,07  0,66
 Tous les utilisateurs, lot 1 - lot 3  -0,21  0,52  0,11  0,71
 Reproductibilité pour chacun des lots et entre tous les utilisateurs 
 Tous les lots, utilisateurs A - A  0,00  0,00  0,00  0,00
 Tous les lots, utilisateurs A - B  -0,46  0,44  -0,06  0,69
 Tous les lots, utilisateurs A - C  -0,31  0,60  -0,15  0,71    
Utilisateur : technicien ayant mené l’étude.
Lot : numéro de lot de kits utilisé dans cette étude.
É.T. : écart-type.
Les valeurs moyennes ΔΔCT (N = 120) et les écarts-types sont indiqués pour les données présentées aux figures « Reproductibilité entre les utilisateurs » et « Reproductibilité entre les lots de kits »

Principle

Le kit PAXgene Blood RNA est destiné à la purification de l’ARN total de 2,5 ml de sang total humain prélevé dans un tube PAXgene Blood RNA. La procédure est simple et peut être réalisée de façon manuelle ou automatique (voir schémas « Procédure manuelle PAXgene Blood RNA » et « Procédure automatisée PAXgene Blood RNA »). 

Les tubes PAXgene Blood RNA présentent une composition de réactifs exclusive fondée sur une technique brevetée de stabilisation de l’ARN (brevets américains 6,602,718 et 6,617,170). Cette composition de réactifs protège les molécules d’ARN de la dégradation par les RNases et minimise les modifications ex vivo de l’expression du gène. Les tubes PAXgene Blood RNA sont destinés au prélèvement de sang total et à la stabilisation d’ARN intracellulaire pour une durée maximale de 3 jours à une température comprise entre 18 et 25 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 18 et 25 °C : IL1B ») ou jusqu’à 5 jours entre 2 et 8 °C (voir figures « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : FOS » et « Stabilité de l’ARN entre 2 et 8 °C : IL1B »). Les données actuellement disponibles indiquent une stabilisation de l’ARN cellulaire pendant au moins 60 mois à -20 °C ou -70 °C.

Procedure

La procédure PAXgene Blood RNA est simple et peut être réalisée de façon manuelle ou automatique (voir schémas « Procédure manuelle PAXgene Blood RNA » et « Procédure automatisée PAXgene Blood RNA »).

Procédure manuelle PAXgene Blood RNA

Le culot remis en suspension est incubé dans des tampons optimisés avec de la protéinase K pour entraîner la digestion des protéines. En outre, une centrifugation est effectuée par moyen de la colonne de centrifugation PAXgene Shredder afin d’homogénéiser le lysat de cellules et d’éliminer les débris cellulaires résiduels. Le surnageant de la fraction intermédiaire est transféré dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. De l’éthanol est ajouté afin d’ajuster les conditions de liaison et le lysat est appliqué sur une colonne de centrifugation PAXgene RNA. Lors d’une brève centrifugation, l’ARN est lié de manière sélective à la membrane de silice PAXgene et les contaminants passent à travers. Les contaminants restants sont éliminés par plusieurs étapes de lavage efficaces. Entre la première et la deuxième étape de lavage, la membrane est traitée avec de la DNase I afin de supprimer les traces d’ADN lié. Après les étapes de lavage, l’ARN est élué dans un tampon d’élution et subit une dénaturation thermique.

Procédure automatisée PAXgene Blood RNA

La préparation des échantillons, automatisée sur le QIAcube, suit les mêmes étapes que la procédure manuelle et vous permet de continuer à utiliser le kit PAXgene Blood RNA pour la purification d’ARN de haute qualité. 

Le protocole automatisé de purification d’ARN consiste en 2 parties (ou protocoles) : « PAXgene Blood RNA Part A » et « PAXgene Blood RNA Part B » avec une brève intervention manuelle entre les 2 parties.

Le culot d’acide nucléique centrifugé, lavé et remis en suspension est transféré du tube PAXgene Blood RNA aux tubes de traitement, lesquels sont placés dans l’agitateur thermique sur la table de travail QIAcube. L’opérateur sélectionne et lance le protocole « PAXgene Blood RNA Part A » à partir du menu. Le QIAcube effectue les étapes du protocole jusqu’à l’élution de l’ARN dans le tampon d’élution. L’opérateur transfère les tubes de microcentrifugeuse, qui contiennent l’ARN purifié, dans l’agitateur thermique du QIAcube. Il lance alors le protocole « PAXgene Blood RNA Part B » à partir du menu, et la dénaturation thermique est effectuée par le QIAcube.

La durée moyenne de préparation des échantillons (fondée sur les données de 12 préparations d’échantillons) est de 125 minutes, dont seulement 20 minutes environ de manipulation.

Applications

Lorsque le kit est utilisé conjointement aux tubes PAXgene Blood RNA, le système fournit de l’ARN intracellulaire de sang total pour la RT-PCR utilisée dans le test de diagnostic moléculaire.

Features
Specifications
Applications PCR en temps réel
CE/FDA/IVD compatible CE-IVD
Elution volume 40 µl
Format Colonne de centrifugation
Main sample type Sang total
Processing Manuel (centrifugation)
Sample amount 2.5 ml
Technology Technologie de silice
Time per run 90 min/12 échantillons
Yield >3 µg
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Application Notes (2)
In situ stability of RNA in blood specimens stored for 8 years (96 months) at –20°C and –70°C in PAXgene Blood RNA Tubes

 


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Typical total RNA yields from PAXgene Blood RNA Tubes processed with the PAXgene Blood RNA Kit
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