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therascreen NRAS Pyro Kit

Pour la détection et la quantification de mutations de l’oncogène NRAS par séquençage
  • Conforme à la directive européenne IVD 98/79/CE
  • Résultats complets en temps-réel
  • Quantification précise de mutations du gène NRAS
  • Interprétation aisée des informations de séquences complexes
Le kit therascreen NRAS Pyro est un kit de détection moléculaire destiné à l’identification de mutations du gène NRAS. Ce kit inclut les amorces et les réactifs pour l’amplification du gène NRAS, ainsi que les tampons, amorces et réactifs pour la détection et la quantification des mutations en temps réel via la technologie de pyroséquençage (Pyrosequencing) sur le système PyroMark Q24. (1)
Cat No./ID: 971530
therascreen NRAS Pyro Kit (24)
Pour 24 réactions : amorces Séq, amorces de PCR, ADN de contrôle non méthylé, Master Mix PCR PyroMark, CoralLoad concentré, tampons et réactifs therascreen
L’utilisation du kit therascreen NRAS Pyro est destinée au diagnostic in vitro.

Références

1. Manuel du kit therascreen NRAS Pyro. Version 1, révision 2, Août 2011.

© QIAGEN France S.A.S. 2013
Les informations relatives aux dispositifs médicaux in vivo et in vitro contenues dans ce site sont à destination des professionnels de santé. Pour plus dinformations, nous vous invitons à consulter le manuel dutilisation de léquipement et/ou la notice dutilisation du réactif.

Le site web n’est pas disponible en français dans son intégralité. Son contenu est international et peut aller à l’encontre des règlementations locales.
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Linéarité de la mutation GGT -> GAT.

Linéarité de la mutation GGT -> GAT au niveau du codon 12.

Performance
Linéarité

La linéarité a été déterminée à l’aide de mélanges de plasmides porteurs de la séquence sauvage ou mutante pour les mutations GGT -> GAT au niveau des codons 12 et 13 et la mutation CAA -> CGA au niveau du codon 61 (voir figure « Linéarité de la mutation GGT -> GAT »). Les plasmides ont été mélangés dans des proportions permettant d’obtenir quatre niveaux de mutation (5, 10, 30 et 50 %). Chaque mélange a été analysé avec trois lots différents du kit therascreen NRAS Pyro, lors de trois analyses de pyroséquençage portant chacune sur trois réplicats. (1)

Les résultats étaient linéaires, avec une non-linéarité autorisée de 5 unités % dans l’intervalle testé de 5 à 50 % de niveau de mutation. Des résultats similaires ont été obtenus pour les mutations GGT -> GAT au niveau du codon 13 et CAA -> CGA au niveau du codon 61. (1)

Précision

Les données de précision permettent de déterminer la variabilité totale des tests. Elles ont été obtenues pour trois niveaux différents, par analyse des mélanges de plasmides susmentionnés, avec trois réplicats chacun. (1)

La répétabilité (variabilité intra-test et inter-lot) a été calculée à partir des données utilisées pour déterminer la linéarité (trois analyses réalisées le même jour avec divers lots du kit therascreen NRAS Pyro). La précision moyenne (variabilité intra-laboratoire) a été déterminée lors de trois analyses réalisées dans un seul laboratoire, trois jours différents, par des opérateurs, sur des systèmes PyroMark Q24 et avec des lots du kit therascreen NRAS Pyro variables. La reproductibilité (variabilité inter-laboratoire) a été calculée à partir de deux analyses réalisées chacune dans un laboratoire interne et dans un laboratoire externe, avec divers lots du kit therascreen NRAS Pyro. (1)

La répétabilité, la précision moyenne et la reproductibilité de la mutation GGT -> GAT au niveau du codon 12 étaient respectivement de 1,2–1,9, 1,0–2,0 et 1,3–3,1 unités de %, dans les limites mesurées d’un niveau de mutation compris entre 5 et 50 %. Des résultats similaires ont été obtenus pour les mutations GGT -> GAT au niveau du codon 13 et CAA -> CGA au niveau du codon 61. (1)

Précision pour la mutation GGT->GAT au niveau du codon 12
% de plasmides mutés

Répétabilité (moyenne, É.T.)

Précision moyenne (moyenne, É.T.)

Reproductibilité (moyenne, É.T.)

7,5 ; 1,2 7,3 ; 1,0 6,7 ; 1,3
10 14,6 ; 1,3 13,5 ; 1,1 13,7 ; 1,3
30 37,8 ; 1,9 37,9 ; 1,5 36,1 ; 2,9
50 59,8 ; 1,7 60,4 ; 2,0 57,5 ;, 3,1
Toutes les valeurs sont données en unités %. % de plasmides mutés sur la base de la mesure DO260, É.T. : écart-type (n=9 pour répétabilité et précision moyenne, n=12 pour reproductibilité). (1)

 

Principle

Le kit therascreen NRAS Pyro est utilisé pour les mesures quantitatives de mutations des codons 12, 13 et 61 du gène NRAS humain en temps réel, à l’aide de la technologie de pyroséquençage sur le système PyroMark Q24. Le gène NRAS encode un homologue de l’oncogène viral du neuroblastome RAS de la GTPase (v-ras). Les mutations de NRAS sont présentes dans environ 13 à 25 % de l’ensemble des mélanomes malins et interviennent fréquemment dans les codons 12, 13 et 61. Ces mutations entraînent l’activation constitutive de voies de signalisation du NRAS. (1)

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 12/13 : G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V
Codon 61 : Q61E, Q61H, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R

Procedure
Le produit contient 2 tests : le premier pour la détection des mutations au niveau des codons 12 et 13, le second pour la détection des mutations au niveau du codon 61 (voir figures « Illustration du test NRAS » et « Tracé de pyrogramme d’un génotype normal des codons 12 et 13 »). Les deux régions sont amplifiées séparément par PCR et séquencées dans la région définie. Les séquences entourant les positions définies servent de valeurs maximales de normalisation et de référence pour l’évaluation quantitative et qualitative de l’analyse. (1) 

Après l’utilisation des amorces PCR ciblant les codons 12/13 et le codon 61, les amplicons sont immobilisés sur des billes de sépharose recouvertes de streptavidine (Streptavidin Sepharose High Performance). L’ADN simple brin est préparé et les amorces de séquence correspondantes s’hybrident avec l’ADN. Les échantillons sont ensuite analysés sur le système PyroMark Q24 à l’aide d’un fichier de configuration d’analyse et d’un fichier d’analyse. La fonction « Sequence to Analyze » (séquence à analyser) peut être ajustée afin de détecter les mutations rares après l’analyse (voir figures « Tracé de pyrogramme de la mutation GGT -> AGT au niveau de la base 1 du codon 12 » et « Tracé de pyrogramme après la réanalyse de l’échantillon dans la figure précédente »). (1) 

Applications

Le kit therascreen NRAS Pyro est utilisé pour les mesures quantitatives de mutations des codons 12,13 et 61 du gène NRAS humain. Ce kit a été conçu pour faciliter l’identification des patients atteints de cancer les plus à même de bénéficier de traitements agissant spécifiquement sur le gène NRAS ou sur les sites dans lesquels le gène NRAS joue un rôle déterminant.

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 12 : G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V
Codon 13 : G13A, G13C, G13D, G13R, G13S, G13V
Codon 61 : Q61E, Q61H, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R
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