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therascreen BRAF Pyro Kit

Pour la détection et la quantification de mutations de l’oncogène BRAF par séquençage
  • Conforme à directive européenne IVD 98/79/CE
  • Résultats complets en temps-réel
  • Quantification précise des mutations de l’oncogène BRAF
  • Interprétation aisée des informations de séquences complexes
Le kit therascreen BRAF Pyro est un kit de détection moléculaire destiné à l’identification de mutations du gène BRAF. Ce kit inclut les amorces et les réactifs pour l’amplification du gène BRAF, ainsi que les tampons, amorces et réactifs pour la détection et la quantification des mutations en temps réel via la technologie de pyroséquençage (Pyrosequencing) sur le système PyroMark Q24. (1)
Cat No./ID: 971470
therascreen BRAF Pyro Kit (24)
Pour 24 réactions sur les systèmes PyroMark Q24 : Amorces Séq, amorces de PCR, ADN de contrôle non méthylé, Master Mix PCR PyroMark, CoralLoad concentré, tampon de liaison PyroMark, tampon d'hybridation
PyroMark, solution de dénaturation PyroMark, tampon de lavage PyroMark, mélange d'enzyme, mélange de substrat, dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP et H2O

L’utilisation du kit therascreen BRAF Pyro est destinée au diagnostic in vitro.

1. Manuel du kit therascreen BRAF Pyro. Version 2, révision 1. Décembre 2012.

© QIAGEN France S.A.S. 2013
Les informations relatives aux dispositifs médicaux in vivo et in vitro contenues dans ce site sont à destination des professionnels de santé. Pour plus dinformations, nous vous invitons à consulter le manuel dutilisation de léquipement et/ou la notice dutilisation du réactif.
Le site web n’est pas disponible en français dans son intégralité. Son contenu est international et peut aller à l’encontre des règlementations locales.
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Linéarité de la mutation V600E.

Linéarité de la mutation V600E (GTG->GAG) dans le codon 600.

Performance
Linéarité

La linéarité a été déterminée à l’aide de mélanges de plasmides porteurs du type sauvage ou de la séquence mutante pour la mutation V600E (GTG->GAG) au niveau du codon 600 du gène BRAF (voir figure « Linéarité de la mutation V600E »). Les plasmides ont été mélangés dans des proportions permettant d’obtenir quatre niveaux de mutation (5, 10, 30 et 50 %). Chaque mélange a été analysé avec trois lots différents du kit therascreen BRAF Pyro, lors de trois analyses de pyroséquençage portant chacune sur trois réplicats. (1)

Les résultats étaient linéaires, avec une non-linéarité autorisée de 5 unités de % dans l’intervalle testé de 5 à 50 % de niveau de mutation. (1)

Précision

Les données de précision permettent de déterminer la variabilité totale des tests. Elles ont été obtenues pour trois niveaux différents, par analyse des mélanges de plasmides susmentionnés, avec trois réplicats chacun.

La répétabilité (variabilité intra-test et inter-lot) a été calculée sur la base des données utilisées pour déterminer la linéarité (trois analyses réalisées le même jour avec divers lots du kit therascreen BRAF Pyro). La précision moyenne (variabilité intra-laboratoire) a été déterminée lors de trois analyses réalisées dans un seul laboratoire, trois jours différents, par des opérateurs différents, sur des systèmes PyroMark Q24 différents et avec des lots du kit therascreen BRAF Pyro différents. La reproductibilité (variabilité interlaboratoire) a été calculée à partir de deux analyses réalisées chacune dans un laboratoire interne et dans un laboratoire externe, avec divers lots du kit therascreen BRAF Pyro. (1)

Les estimations de la précision sont exprimées en tant qu’écart-type des fréquences de mutation mesurées, en unités %. La répétabilité, la précision moyenne et la reproductibilité de la mutation V600E (GTG->GAG) au niveau du codon 600 étaient respectivement de 0,6-2,1 ; 0,7-1,8 et 0,8–2,1 unités de %, dans les limites mesurées d’un niveau de mutation compris entre 5 et 50 %. (1)

Valeurs de précision pour la mutation V600E (GTG->GAG) au niveau du codon 600

% de plasmides mutés

Répétabilité (moyenne, É.T.)

Précision moyenne (moyenne, É.T.)

Reproductibilité (moyenne, É.T.)

5

5,2 ; 0,6 4,4 ; 0,7 5,1 ; 0,8
10

9,1 ; 1,0

9,6 ; 1,0 9,6 ; 1,3
30 28,1 ; 2,1 27,9 ; 1,8 28,3 ; 2,1
50 46,9 ; 1,2 46,3 ; 1,5 47,9 ; 1,7
Toutes les valeurs sont données en unités %. É.T. : écart type (n = 9). % de plasmides mutés sur la base de la mesure DO260 (1)
Principle

Le kit therascreen BRAF Pyro est utilisé pour les mesures quantitatives de mutations des codons 600 et 464 à 469 du gène BRAF humain en temps réel, à l’aide de la technologie de pyroséquençage sur le système PyroMark Q24. Le gène BRAF encode l’homologue B1 de l’oncogène viral kinase V-raf murine sarcoma, un proto-oncogène agissant en aval de l’EGFR. Les mutations du gène BRAF sont trouvées dans 6 à 8 % de tous les cancers et plus fréquemment dans le mélanome (50 à 60 %), le cancer colorectal (10 %) et les cancers de la thyroïde (39 %). Environ 90 % de ces mutations sont des substitutions V600E. (1)

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 600 : V600A, V600E, V600G et V600M
Codons 464 à 469 : G464E, G464V, G466E, G466V, G469A, G469E et G469V
Procedure
Le produit contient 2 tests : le premier pour la détection des mutations au niveau du codon 600 et le second pour la détection des mutations au niveau des codons 464 à 469 (voir figure « Illustration du test BRAF »). Les deux régions sont amplifiées séparément par PCR et séquencées dans la région définie. Les séquences entourant les positions définies servent de valeurs maximales de normalisation et de référence pour l’évaluation quantitative et qualitative de l’analyse. (1) 

Après la PCR à l’aide des amorces ciblant le codon 600 et les codons 464 à 469, les amplicons sont immobilisés sur des billes de sépharose recouvertes de streptavidine (Streptavidin Sepharose High Performance). L’ADN simple brin est préparé et les amorces de séquence correspondantes s’hybrident avec l’ADN. Les échantillons sont ensuite analysés sur le système PyroMark Q24 à l’aide d’un fichier de configuration d’analyse et d’un fichier d’analyse (voir figures « Tracé de pyrogramme d’un génotype normal au niveau du codon 600 », « Tracé de pyrogramme d’un génotype normal au niveau des codons 464 à 469 » et « Tracé de pyrogramme de la mutation GTG->GAG dans la base 2 du codon 600 »). La fonction « Sequence to Analyze » (séquence à analyser) peut être ajustée afin de détecter les mutations rares après l’analyse. (1)

Applications

Le kit therascreen BRAF Pyro a été conçu pour faciliter l’identification des patients atteints de mélanome ou de cancer colorectal les plus à même de bénéficier d’un traitement anticancéreux par inhibiteurs sélectifs du BRAF. Le kit est utilisé pour la détection des mutations au niveau des codons 600 et 464 à 469 du gène BRAF humain. (1)

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 600 : V600A, V600E, V600G et V600M (1)
Codons 464 à 469 : G464E, G464V, G466E, G466V, G469A, G469E et G469V (1)
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