HiSpeed Plasmid Mega y Giga EF Kits

• Aproximadamente 50 minutos de tiempo de preparación
• Aclaramiento de lisado y precipitación de isopropanol sin centrifugación
• Sin riesgo de pérdida de sedimento de ADN durante la precipitación
• Rendimiento de ADN plasmídico de alto número de copias de hasta 10 mg
• LyseBlue para lisado óptimo y máximo rendimiento de ADN
• Eliminación de endotoxinas incluida (<0,04 UE/μg de ADN)

Los HiSpeed Plasmid Mega y Giga EF Kits proporcionan una preparación de ADN plasmídico basada en el intercambio aniónico a gran escala y accionada por vacío, y solo requieren un paso de centrifugación para eluir el ADN plasmídico final. El ADN purificado es equivalente al obtenido por centrifugación en gradiente 2 × CsCl y es apto para aplicaciones que requieran grado de transfección. Para el protocolo, se requiere un colector de vacío QIAvac HiSpeed LS.

Los HiSpeed EF Mega Giga Kits deben usarse junto con el QIAvac HiSpeed LS.

Los HiSpeed Plasmid Mega y Giga EF Kits contienen QIAfilter Cartridges, HiSpeed Tips y módulos QIAconcentrator para una preparación de plásmidos rápida y a gran escala con el colector de vacío. El módulo QIAfilter accionado por vacío sustituye el paso de centrifugación en el procedimiento clásico de intercambio aniónico, haciendo que la purificación sea más rápida y cómoda. El QIAconcentrator proporciona ADN altamente concentrado por centrifugación después de la precipitación con etanol. Se pueden purificar hasta 2,5 mg (Mega) o 10 mg (Giga) de ADN plasmídico de alto número de copias a partir de 500 ml o 2,5 l de cultivo, respectivamente (los volúmenes de cultivo dependen del número de copias del plásmido, el tamaño del inserto, la cepa huésped y el medio de cultivo). El diseño de HiSpeed Tip permite una tasa de flujo muy alta, lo que permite los pasos de unión de ADN, el lavado y la elución para la purificación de plásmidos para continuar con más rapidez. El ADN plasmídico derivado HiSpeed no contiene endotoxinas (<0,04 UE/µg de ADN).

La exclusiva resina de intercambio aniónico de HiSpeed Tips se ha desarrollado exclusivamente para la purificación de ácidos nucleicos. Sus excepcionales propiedades de separación dan como resultado una pureza del ADN equivalente o superior a la obtenida mediante dos rondas sucesivas de centrifugación en gradiente de CsCl. Los HiSpeed Plasmid Mega y Giga EF Kits eliminan endotoxinas bacterianas que se liberan durante el paso de la lisis e influyen en la transfección de ADN en células primarias y células de cultivo sensibles. El ADN sin endotoxinas obtenido de los HiSpeed Plasmid Mega/Giga EF Kits es muy adecudo para conseguir resultados reproducibles y fiables en la transfección. El ADN sin endotoxinas ultrapuro QIAGEN también es apto para la investigación en terapia génica y otras aplicaciones sensibles.

Los QIAfilter Cartridges (véase la figura “ QIAfilter Mega-Giga Cartridge”), son unidades de filtrado especiales diseñadas para sustituir el paso de centrifugación después de la lisis alcalina de células bacterianas. Los QIAfilter Cartridges eliminan completamente los precipitados de SDS y aclaran los lisados bacterianos en una fracción del tiempo necesario para la centrifugación. Las HiSpeed Tips preenvasadas funcionan mediante flujo de gravedad y nunca se secan, lo que reduce al mínimo el tiempo de manipulación necesario para la preparación de plásmidos.

El exclusivo QIAconcentrator (véase la figura “ Procedimiento de HighSpeed Plasmid Giga EF”) sustituye al paso de centrifugación utilizado tradicionalmente para recoger el ADN precipitado con isopropanol tras la purificación. El módulo QIAconcentrator atrapa el ADN precipitado, mientras que la mezcla de isopropanol y tampón fluye a través del mismo. A continuación, el ADN se eluye simplemente del QIAprecipitador en un tubo de recogida con tampón TE o agua. Este módulo exclusivo también elimina el riesgo de pérdida de sedimento, que puede producirse durante la decantación del sobrenadante tras la centrifugación.

Las endotoxinas, también conocidas como lipopolisacáridos o LPS, son componentes de la membrana celular de bacterias gramnegativas como E. coli (véase la figura “ Pared celular bacteriana”. Las endotoxinas se liberan durante el paso de la lisis de purificación de plásmidos y reducen significativamente la eficacia de la transfección en estirpes celulares sensibles de endotoxinas. Además, las endotoxinas pueden influir en la captación de ADN plasmídico en experimentos de transfección al competir con el ADN por el reactivo de transfección “libre”.

Las endotoxinas también inducen una activación inespecífica de las respuestas inmunitarias en células inmunitarias como los macrófagos y las células B, lo que puede dar lugar a una interpretación errónea de los resultados de la transfección. Estas respuestas incluyen la inducción de síntesis de proteínas y lípidos, como IL-1 y prostaglandina. En resumen, las endotoxinas representan una variable no controlable en la configuración de los experimentos de transfección, que influyen en el resultado y la reproducibilidad de estos y dificultan su comparación e interpretación. En investigación de terapia génica, las endotoxinas puede interferir y causar síndrome de choque endotóxico y activación de la cascada de complementos. >

Los lisados bacterianos neutralizados se incuban en el QIAfilter Cartridge y se aclaran en segundos mediante vacío. En esta fase, el Endotoxin Removal Buffer se añade al lisado filtrado. No es necesaria la incubación. El filtrado se aplica a una punta HiSpeed para la purificación del ADN plasmídico (véase la figura “ Procedimiento de HiSpeed Plasmid Giga EF”). El ADN eluido se mezcla con isopropanol y se aplica al QIAconcentrator utilizando vacío y se lava. A continuación, el ADN concentrado y desalado se eluye del QIAconcentrator directamente en un tubo de recogida nuevo con tampón TE o agua.

El ADN purificado con los HiSpeed Plasmid Mega y Giga EF Kits da excelentes resultados en todas las aplicaciones, desde la clonación y la secuenciación, hasta la transfección de células muy sensibles y células primarias, y el silenciamiento génico mediado por plásmidos.