Explicación de la secuenciación del ARN
La secuenciación del ARN (RNA-seq) es una tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) altamente sensible y precisa que impulsa nuevos descubrimientos en la investigación de la transcriptómica y la expresión génica. Al capturar el conjunto completo de los transcritos de ARN en una muestra biológica, la secuenciación del ARN ofrece:
- Mayor rango dinámico para el análisis de la expresión génica
- Mayor especificidad para detectar los transcritos de baja abundancia
- Descubrimiento de nuevas isoformas cruciales para la genómica del cáncer, la inmunología, la investigación del microbioma y el desarrollo de fármacos
El flujo de trabajo de secuenciación del ARN comienza con el aislamiento del ARN de células o tejidos, seguido de la preparación de genotecas, donde el ARN se convierte en ADNc, se fragmenta y se liga con adaptadores de secuenciación. A continuación, se prepara la genoteca de secuenciación de ARN para generar millones de lecturas, que se analizan mediante herramientas bioinformáticas para obtener información sobre el transcriptoma.
¿Se enfrenta a retos con muestras de ARN degradado o de bajo rendimiento? Maximice el rendimiento de su secuenciación de ARN con las soluciones QIAseq RNA-seq, diseñadas para superar la complejidad del transcriptoma, por ejemplo, mejorando las lecturas de expresión génica en el objetivo o aumentando la sensibilidad para muestras de baja calidad o FFPE, todo ello ahorrando tiempo y esfuerzo.
Extracción de ARN para secuenciación de ARN
El ARN se puede extraer de diversas fuentes, como sangre total, heces/microbioma, células cultivadas y tejidos frescos, congelados o FFPE. Las células cultivadas suelen producir ARN homogéneo y de alta calidad, pero el tipo de muestra óptimo depende de la cuestión biológica; por ejemplo, las biopsias de tumores pequeños pueden ser heterogéneas y de bajo rendimiento.
La calidad del ARN refleja en gran medida la calidad y la manipulación del material de partida: lo ideal es que sea fresco, pero es fundamental estabilizarlo inmediatamente y almacenarlo adecuadamente, así como minimizar los ciclos de congelación-descongelación.
Los pasos típicos incluyen la estabilización de la muestra, la disrupción y homogeneización, la purificación del ARN, la concentración y el control de calidad para la cuantificación y la evaluación de la integridad.
Enriquecimiento de ARNm y eliminación de ARN
Introducción a la secuenciación masiva de ARN
La secuenciación masiva de ARN (bulk RNA-seq) es un método de análisis del transcriptoma que consiste en extraer y secuenciar ARN agrupado de poblaciones celulares, tejidos o biopsias.
A diferencia de la secuenciación de ARN de células individuales, la secuenciación masiva de ARN mide los niveles medios de expresión génica en diferentes condiciones o muestras, lo que la hace especialmente útil para analizar tejidos complejos o grandes poblaciones celulares en las que no se requiere. Se utiliza habitualmente en la elaboración de perfiles transcriptómicos completos, el análisis diferencial de la expresión génica, la investigación de biomarcadores y los estudios de genómica funcional.
Un flujo de trabajo típico de secuenciación masiva de ARN incluye la preparación de genotecas (ya sea catenario o no catenario), que comienza con la extracción directa de ARN y la amplificación de tejidos y poblaciones celulares, la síntesis de ADNc y la adición de adaptadores o uniones. Es posible que sea necesario enriquecer el ARNm o agotar el ARN ribosómico (ARNr) para la secuenciación del ARN total. A continuación, la genoteca preparada pasa por una secuenciación en una plataforma de alto rendimiento, lo que permite un análisis sólido del panorama transcriptómico.
La preparación de genotecas en hebras (direccional) conserva la polaridad de los transcritos. Esto es importante cuando los transcritos se superponen en cadenas opuestas (antisentido/ARNlnc, superposiciones UTR), ya que los datos con cadena asignan las lecturas al gen correcto y reducen los recuentos “ambiguos”; varias evaluaciones muestran una mejor cuantificación en las regiones superpuestas en comparación con los datos sin cadena.
Métodos de preparación de genoteca de secuenciación de ARN
La elección del método adecuado para la preparación de genotecas de secuenciación de ARN depende de varios factores, entre ellos el objetivo experimental, el presupuesto y la disponibilidad de un transcriptoma de referencia para el organismo de interés.
Los kits de preparación de genotecas QIAseq mencionados aquí son compatibles con la mayoría de los secuenciadores de rendimiento medio y alto disponibles en el mercado.
Secuenciación de ARN total
Secuenciación de mARN
Secuenciación de ARN de 3’
Secuenciación de miARN
Secuenciación de ARN de bajo rendimiento
Secuenciación de ARN blanco
Introducción a la secuenciación de ARN unicelular
La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) estudia la heterogeneidad de los transcritos de ARN a nivel unicelular, revelando diversos tipos de células, funciones e interacciones dentro de tejidos y organismos complejos. Esto la hace especialmente útil para estudiar procesos dinámicos como la diferenciación, la proliferación y la tumorigénesis.
Flujo de trabajo estándar de scRNA-seq
- Aislamiento celular: se aíslan células individuales de tejidos a granel o suspensiones celulares
- Captura de ARNm y síntesis de ADNc: se extrae el ARNm poliadenilado y se convierte en ADNc.
- Preparación de genotecas: se añaden identificadores moleculares únicos (UMI) y códigos de barras celulares para diferenciar las transcritos por célula
- Secuenciación: las genotecas se secuencian en plataformas
- Análisis bioinformático: se analizan las lecturas para generar perfiles de expresión génica para cada célula
Trabajar con células individuales o ARN limitado no tiene por qué significar limitar su visión del transcriptoma.
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Con una tecnología de amplificación superior a la PCR, QIAseq Single Cell REPLI-g permite realizar estudios del genoma y el transcriptoma a partir de células individuales u otras muestras de ADN/ARN de bajo rendimiento, proporcionando una cobertura confiable y una representación uniforme.
Análisis de secuenciación de ARN
Historias de éxito
Consiga resultados óptimos de la secuenciación de ARN a partir de muestras de ARN degradadas, de baja calidad o difíciles de secuenciar
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