Saliente o romo: modificación, hibridación y ligadura
Enzimas para clonación
Es posible que se requiera una modificación terminal de los extremos antes de que se pueda clonar el ADN del molde en un vector plásmido adecuado. Por lo general, el ADN identificado para la clonación se aísla de la fuente mediante digestión enzimática de restricción o la amplificación por PCR. Las enzimas especializadas como Klenow Fragment, T4 DNA polymerase y T4 polynucleotide kinase modifican los extremos de 3’ o 5’ para mejorar la unión covalente entre los fragmentos de ADN y el vector.
El paso siguiente de la clonación es la ligadura con una enzima adecuada para hibridar los extremos del vector y el inserto.
La adición suele realizarse en la preparación de un vector-T para utilizarlo en la clonación de TA o para añadir una secuencia de “A” a un producto de PCR producido por una polimerasa de alta fidelidad (no Taq) para su uso en la clonación de TA. Los productos de amplificación con ADN polimerasa Taq ya tienen una secuencia de “A”.
Modificación terminal del ADN
* La actividad de exonucleasa 3’→5’ de T4 DNA Polymerase es fundamental para el protocolo de clonación independiente de secuencia y ligadura (SLIC).
† La conversión a ADN de extremo romo se obtiene explotando las actividades de polimerasa 5’→3’ y la actividad de exonucleasa 3’→5’ de T4 DNA Polymerase (P7080). La T4 Polynucleotide Kinase (Y9040) garantiza que los extremos de los fragmentos de ADN de extremo romo sean 5’ fosforilados para una posterior ligadura con T4 DNA Ligase.
Ligadura de ADN
† Termoestable; para la ligadura exacta de mellas sin espacios o pares de bases discordantes.
Es un método SLIC de clonación
La clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC) aprovecha la actividad enzimática de la exonucleasa:
Clonación para secuenciación de última generación
Una librería destinada a la secuenciación de última generación comienza por el ADN fragmentado. La acción enzimática completa los pasos de clonación.
Todos los componentes enzimáticos necesarios para la construcción de librerías de ADN pueden ensamblarse con adaptadores en un kit de preparación de librerías “propio”.
Síntesis génica
La síntesis génica se basa en la unión de oligodeoxinucleotidos que presentan extensas zonas de superposición complementaria.
Descubra las enzimas destacadas para la clonación y la recombinación de ADN
Preguntas frecuentes sobre enzimas para clonación y recombinación
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