Metagenom-Sequenzierung

Mikrobielle Gemeinschaften verstehen

Die Mikrobiomforschung hilft uns dabei, besser zu verstehen, wie Bakterien, Pilze, Archaeen und Viren unser Leben und unsere Umwelt beeinflussen. Früher waren die Mikrobiomforschung und Charakterisierung unserer mikrobiellen Welt auf kultivierbare Mikroorganismen beschränkt. 

Allerdings können nicht alle Mikroorganismen in Kulturen gezüchtet werden, und die künstliche Reinkultur beraubt die Mikroorganismen ihrer Interaktionen mit anderen Arten, die ihre Eigenschaften, ihr Verhalten und ihren evolutionären Weg bestimmen. Das bedeutet, dass die Genotypen und Phänotypen der Mikroorganismen in Petrischalen sehr wahrscheinlich anders sind als in der freien Natur ⁽¹⁾. 

Mithilfe mikrobieller Next-Generation-Sequencing(NGS)-Verfahren können wir wichtige genetische Erkenntnisse über die Mikroorganismen gewinnen, die in, auf und um uns herum leben. 

Was ist Metagenomik oder Metagenom-Sequenzierung?

Metagenomik oder Gemeinschaftsgenomik ist die genetische Analyse von Mikroorganismen-Gemeinschaften in ihrer natürlichen Lebensumgebung, ohne einzelne Arten zu isolieren und zu kultivieren. Sie liefert umfassende Einblicke in die biochemischen und metabolischen Wechselwirkungen innerhalb dieser Gemeinschaften.  

Die Metagenomik kann auch dabei helfen, einzelne Arten innerhalb mikrobieller Lebensräume ohne vorherige Isolierung zu identifizieren. Zudem kann sie die Anpassungsmechanismen von Mikroorganismen unter Umweltstress und ihre Interaktionen innerhalb der Gemeinschaften und mit anderen Komponenten ihrer Umgebung sichtbar machen.

Metagenomik für die Mikrobiomforschung

Derzeit gibt es drei gängige Methoden der metagenomischen Sequenzierung. Die Gesamtgenom-Shotgun-Sequenzierung bietet die Möglichkeit, neben Bakterien gleichzeitig auch nichtbakterielle Mikroorganismen (z. B. Pilze und Viren) zu untersuchen ^(2),, was jedoch ein höheres Sequenzierungsbudget erfordert. Alternativ können Sie sich mit der 16S/18S/ITS-Sequenzierung ausschließlich auf zielgerichtete Regionen konzentrieren. Sie ist für Untersuchungen zur bakteriellen Phylogenie und Taxonomie geeignet ⁽³⁾. Die Metatranskriptomik als Untersuchung der Genexpression der Gemeinschaft bietet dynamische Einblicke, beispielsweise in Stoffwechselaktivitäten und Wechselwirkungen zwischen Wirt und Mikrobiom, die die durch WGS-Shotgun oder 16S/18S/ITS-Sequenzierung gewonnenen statischen Momentaufnahmen der Zusammensetzung und des Potenzials der Gemeinschaft ergänzen.

Darüber hinaus ermöglicht die Methode der Sequenzierung des Metagenoms eine de-novo-Genomassemblierung neuartiger Organismen (wie SARS-CoV-2  zu Beginn der Pandemie), die Vervollständigung der Genome bekannter Organismen oder den Vergleich der Genome hunderter Organismen durch Hochdurchsatzsequenzierung.

Beschränkungen der derzeitigen Verfahren

Metagenomische Sequenzierungsmethoden wie WGS, 16S/18S/ITS und Metatranskriptomik bieten zwar leistungsstarke Tools für die Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften, unterliegen jedoch bestimmten Einschränkungen. 

Die Gesamtgenom-Shotgun-Sequenzierung kann Verzerrungen aufweisen, wie beispielsweise eine ungleichmäßige Genomabdeckung, was die Genauigkeit der Schätzungen zur mikrobiellen Häufigkeit beeinträchtigt ⁽⁴⁾.

Der Amplifikationsschritt bei der 16S/18S/ITS-Sequenzierung kann aufgrund von Unterschieden in der Kopienzahl der ribosomalen Gene und der Möglichkeit von PCR-Artefakten zu einem Bias führen. Dies kann die Darstellung der mikrobiellen Häufigkeiten verzerren ⁽⁵⁾. Darüber hinaus stimmen die bei der 16S/18S/ITS-Sequenzierung verwendeten universellen Primer möglicherweise nicht mit allen Zielsequenzen gleich gut überein, was zu einer unvollständigen oder verzerrten Erkennung einiger Taxa führen kann ⁽⁶⁾.

Die Metatranskriptomik ist faszinierend, aber kompliziert. Bei der Durchführung von RNA-Sequenzierungen komplexer mikrobieller Gemeinschaftsproben können Probleme mit der Sensitivität auftreten. Die Folge? Das Fehlen von On-Target-Reads und die fehlende Erfassung von mRNA-Transkripten mit geringer Häufigkeit. Das bedeutet stundenlange RNA-Seq-Optimierung, um das richtige Ergebnis zu erzielen. Dieser Artikel fasst zusammen, wie man die Verschwendung von RNA-Seq-Reads bei der Metatranskriptom-Analyse vermeiden kann. 

Literatur:

1. National Research Council (US) Committee on Metagenomics: Challenges and Functional Applications. The New Science of Metagenomics: Revealing the Secrets of Our Microbial Planet. Washington (DC): National Academies Press (US); 2007.
2. Jovel, J. et al. (2016) Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Front Microbiol. 7, 459.
3. Janda, J. M. and Abbott, S. L. (2007) 16s rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Clin. Microbiol. 45(9), 2761–2764.
4. Chouvarine, P., Wiehlmann, L., Losada, P., DeLuca, D., & Tümmler, B. (2016). Filtration and Normalization of Sequencing Read Data in Whole-Metagenome Shotgun Samples. PLoS ONE, 11.
5. Khachatryan, L., Leeuw, R., Kraakman, M., Pappas, N., Raa, M., Mei, H., Knijff, P., & Laros, J. (2020). Taxonomic classification and abundance estimation using 16S and WGS-A comparison using controlled reference samples. Forensic science international. Genetics, 46, 102257.
6. Losada, P., Tümmler, B., Wiehlmann, L., & Chouvarine, P. (2014). Whole metagenome shotgun sequencing analysis of microbiome of cystic fibrosis- and COPD patients. European Respiratory Journal, 44, 1212.