Digitale PCR

Digitale Multiplex-PCR

Was ist digitale Multiplex-PCR?

Multiplexing bei der PCR ermöglicht den Nachweis von mehr als einem Target-Molekül oder mehr als einer Target-Sequenz in einer einzigen Reaktion. Multiplexing mit digitaler PCR (dPCR) kann durch Variation der Art der verwendeten Fluorophore erreicht werden. Bei dem traditionellen Mehrfarb-Multiplexing werden die Targets differenziert, indem eine Sonde je Target verwendet wird, die jeweils mit einem Farbstoff mit unterschiedlichem Emissionsspektrum konjugiert ist. Die meisten dPCR-Geräte ermöglichen den Nachweis verschiedener Fluorophore in mindestens zwei speziellen Detektionskanälen. Das QIAcuity Digital PCR System ermöglicht beispielsweise ein Multiplexing für die klare Unterscheidung von bis zu 12 Targets in derselben Reaktion.

Vorteile des dPCR-Multiplexings

Das Multiplexing bei der dPCR ist aufgrund der zahlreichen Vorteile des Multiplexings mit einem dPCR-System ein Thema von zunehmendem Interesse. Der Ansatz kann genutzt werden zur:

  • Analyse mehrerer Targets in einer einzigen Reaktion
  • Reduzierung technischer Fehler wie z. B. Ungenauigkeiten bei der Pipettierung
  • Erhöhung der Wahrscheinlichkeit eines Target-Nachweises
  • Reduzierung der benötigten Probenmenge für die Analyse
  • Bereitstellung einer direkten internen Kontrolle einer Einzelreaktion
  • Einsparung von Zeit und Reagenzien zur Senkung der Gesamtkosten

Multiplexing mit digitaler PCR ermöglicht mehrere Applikationen, die mit Single-Color-Assays nicht möglich oder nur schwierig durchzuführen sind. Einige dieser Analysen sind:

  • Kopienzahlvarianten: Paarung von Target- und Referenzgenen zur Bestimmung ihres Verhältnisses mit einem Duplex-Verfahren
  • Biallelische Variation von Einzelnukleotidvarianten oder kleinen Insertionen/Deletionen: Duplex-Verfahren mit zwei Hydrolysesonden, visualisiert anhand von Two-Color-Plots (1)
  • Genotypisierung: Zählen der Partitionszahlen für einzeln und doppelt positive Cluster (1)
Um die Vorzüge des Multiplexings mit der digitalen PCR vollständig nutzen zu können, ziehen Sie ein digitales PCR-System mit erweiterten Multiplexing-Fähigkeiten in Betracht.

Ein digitales PCR-Gerät mit hoher Multiplexingleistung ermöglicht Ihnen die Analyse mehrerer Targets in einer Probe mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Das QIAcuity Digital PCR System beispielsweise ist in mehreren Konfigurationen verfügbar, um Ihren Anforderungen an die Proben- und Target-Analyse gerecht zu werden.

Der Vorteil von digitaler Nanoplatten-PCR für Multiplex-Reaktionen

Die digitale Multiplex-PCR ist eine bevorzugte Herangehensweise, da die Methode flexibler, sensitiver und spezifischer ist als die Multiplex-qPCR. Multiplexing mit qPCR kann außerdem kompliziertere Methoden zur Berechnung absoluter Werte erfordern, und die Methode ist anfälliger für Interferenzen zwischen mehreren PCRs in einer Reaktion. Mit Softwarefunktionen wie einer anwenderdefinierten Crosstalk-Matrix können Sie Crosstalksignale zwischen benachbarten Kanälen basierend auf Ihren Assay- und Laufparametern adressieren. Dies hilft, Ihre dPCR-Multiplex-Kapazität und Datengenauigkeit im Vergleich zur qPCR weiter zu verbessern.

Die digitale Nanoplatten-PCR bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Arten der digitalen PCR, wie kurze Laufzeiten, hohe Präzision und Sensitivität sowie Optionen für die Multiplexierung höherer Ordnung, einschließlich Amplituden-Multiplexing.

Das QIAcuity-Gerät bietet sechs Farben, die zum Nachweis von Targets in sechs Kanälen plus zwei Hybridkanälen verwendet werden können. Diese Hybridkanäle werden für Long Stokes Shift(LSS)-Farbstoffe verwendet. Wie funktionieren diese Farbstoffe? Die Spektralverschiebung zwischen dem absorbierten Licht und dem emittierten Licht ist in LSS-Farbstoffen im Vergleich zu Standard-Fluoreszenz-Farbstoffen größer. Das bedeutet, dass die Absorption und Emission auf verschiedenen Kanälen erfasst werden – z. B. erfolgt die Anregung mit der Wellenlänge des Standardkanals „Green“, die Emission/Bilderfassung wird jedoch mit dem Filter „Yellow“ durchgeführt. Dies ermöglicht die Analyse von bis zu 8-plex-Reaktionen.

Für noch mehr Targets können Sie die Multiplexierung höherer Ordnung ausprobieren. Mit der Möglichkeit zur Amplituden-Multiplexierung auf dem QIAcuity können Sie mit dem QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit bis zu 12 Targets analysieren. Bei der Amplituden-Multiplexierung werden gleichzeitig zwei Ziele im selben Farbkanal quantifiziert, was effektiv den Daten-Output pro Reaktion verdoppelt. Die QIAcuity-Software (ab Version 3.1) unterstützt die Amplituden-Multiplexierung durch Einführung von drei einstellbaren Schwellenwerten innerhalb des Kanals, um zwischen Target eins, Target zwei und Doppelt-Positiven zu unterscheiden. Mit diesen Schwellenwerten können Sie die Amplifikation jedes Targets in der Probe analysieren.

Fortschrittliche Optionen für Multiplexing höherer Ordnung optimieren Laborressourcen und liefern eine hochauflösende Darstellung genetischer Variationen. Diese Merkmale sind von grundlegender Bedeutung für Applikationen wie die Analyse von Kopienzahlvariationen und den Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere bei begrenzten Probenmengen.

Hauptmerkmale der QIAcuity-Familie

Hochdurchsatz- und Multiplexierungseigenschaften des QIAcuity* Digital PCR Systems für die nicht-klinische Forschung und des QIAcuityDx** Digital PCR Systems für die In-vitro-Diagnostik
  QIAcuity* One 2plex QIAcuity* One 5plex QIAcuity* Four QIAcuity* Eight QIAcuityDx** Four

Detektionskanäle

 2 8a
(6+2 Hybridb)

8a
(6+2 Hybridb)

8a
(6+2 Hybridb)

 5
Multiplexing-Kapazität 4  12c,a  12c,a  12c,a 5

Anzahl der pro Arbeitstag
analysierten Proben

Bis zu 384 

 Bis zu 384  

Bis zu 672 

Bis zu 1248 

 Bis zu 672 (96 Well)d
Bis zu 168 (24 Well) 
Zweck  Nicht-klinische Anwendungen IVD-Anwendungen

Sie haben weitere einführende Fragen zum dPCR-Multiplexing? Schauen Sie, ob unser QIAgenius sie beantworten kann:

Anwendungen der Multiplex-dPCR

Multiplex dPCR-Assays können eine Vielzahl von digitalen PCR-Applikationen unterstützen. Diese reichen von der Zell- und Gentherapie über die Untersuchung von Lebensmittelbetrug und die AAV-Charakterisierung bis hin zum Nachweis von Mikroorganismen und einem Assay für Kopienzahlvariationen.
Multiplex-dPCR-Assays für Lebensmittel-Applikationen

Digitale Multiplex-PCR-Assays haben in der Lebensmittelindustrie ein breites Anwendungsspektrum. Bei behördlichen Kontrollen und der Qualitätssicherung für Lebensmittel können Multiplex-dPCR-Assays zur Identifizierung von Tierarten und zum Nachweis der Herkunft von Fleisch und Fleischprodukten, Fischarten und anderen Arten eingesetzt werden (2, 3). Mit dem digitalen PCR-Multiplexing können Sie z. B. in einer einzigen Reaktion erfolgreich die Herkunft von Schwein, Kamel, Schaf, Esel, Ziege, Kuh und Huhn unterscheiden (2).

Multiplexing mittels dPCR könnte auch für GVO-Tests und die Quantifizierung von Transgenen anhand von Transgen-Endogen-Multiplex-PCR-Reaktionen verwendet werden (4, 27). In einer Studie wurden Duplex-PCR-Assays eingesetzt, um die Konzentrationen des MON810-Transgens mit denen eines HMG-Referenzgens in Futtermaisproben zu vergleichen. Der Multiplex-dPCR-Assay erreichte eine Sensitivität von fünf Target-DNA-Kopien mit besserer Wiederholbarkeit und Toleranz gegenüber Samenpulver-Inhibitoren als qPCR (5).

Die Aufdeckung von Lebensmittelbetrug ist eine weitere wesentliche Applikation des Multiplexings mit digitaler PCR, beispielsweise für den Nachweis von Inhaltsstoffen tierischer Herkunft in verarbeiteten vegetarischen oder veganen Produkten. Ein Multiplex-dPCR-Assay auf Basis der Amplifikation des mitochondrialen Cytochrom-b-Gens, spezifisch für die meisten Tiere, sowie von chloroplastischer DNA, spezifisch für die meisten Pflanzenarten, kann genutzt werden, um Inhaltsstoffe tierischer Herkunft in vegetarischen Lebensmitteln nachzuweisen (6). 

Und schließlich kann die dPCR zum Nachweis schwerer lebensmittelbedingter Erkrankungen verwendet werden. Durch Multiplexing mittels digitaler PCR lassen sich mikrobielle Pathogene wie E. coli, L. monoytogenes, S. aureus und S. enetrica gleichzeitig nachweisen (7).

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Multiplex-dPCR in einem Kopienzahlvariationsassay

In einem Kopienzahlvariationsassay kann das Multiplexing mittels dPCR genutzt werden, um mit einem Duplex-Verfahren Target- und Referenzgene zu paaren und so deren Verhältnis zu ermitteln.

In einer Studie wurde Multiplexing mittels digitaler PCR erfolgreich eingesetzt, um gleichzeitig Genmutationen, Genfusionen und Genduplikationen nachzuweisen (8). Eine gleichzeitige Kopienzahlbeurteilung zweier wichtiger Onkogene bei einem Neuroblastom im Vergleich mit zwei normalen diploiden Referenzgenen war ebenfalls möglich und sparte wertvolles Probenmaterial. Die Multiplex-dPCR-Assays zeigten eine Spezifität und Sensitivität von 100 % für den gleichzeitigen Nachweis von Genmutationen, -fusion und -duplikation (9).

Ein weiteres Beispiel eines Kopienzahlvariationsassays mit dPCR-Multiplexierung ist die Genotypisierung von Proben spinaler Muskelatrophie (SMA). Die Studienautoren verwendeten Multiplexing mit digitaler PCR zur Quantifizierung der Kopienzahlen von SMN1 und SMN2 mit RPPH1 als interne Referenzgenkontrolle (10). Studien haben auch gezeigt, dass Multiplexing mittels digitaler PCR eingesetzt werden kann, um präzise und kostengünstig große Deletionen und Duplikationen im BRCA1-Gen (11) sowie die MET- und HER2-Amplifikation bei nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) nachzuweisen (28).

In einer weiteren Studie wurden Multiplex-dPCR-Assays für die Quantifizierung von Kopienzahlveränderungen (CNA) in 15 genomischen DNA-Biomarkern aus gefrorenen normalen Plattenepithelkarzinomen(SCC)-Proben entwickelt und optimiert (12).

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Quantifizierung von Mutationen anhand von Multiplex-dPCR-Assays

Das Multiplexing von DNA-Targets mittels dPCR ist nützlich für die Quantifizierung somatischer Mutationen, die absolute Allelquantifizierung und den Nachweis seltener Mutationen. Studien zeigen, dass Multiplex-dPCR-Panels für die quantitative Analyse von onkogenen Mutationen in zellfreier DNA (cfDNA) (13) und Plasma verwendet werden können (14, 15).

Es liegen Nachweise vor, dass die Ermittlung optimaler Primer- und Sondenkonzentrationen und optimaler Elongationstemperaturen in Singleplex-Reaktionen die Mühe wert ist. Sie sollten auch auf die Kompatibilität von Primer-Sets und das Vorliegen von Regen bei Duplex-Reaktionen prüfen. Dann können Sie mit Kombinationen in komplexeren Multiplex-dPCR-Reaktionen fortfahren.

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Multiplexing mit dPCR für den Nachweis von Mikroorganismen

Multiplexing mit digitaler PCR wird häufig eingesetzt, um Mikroorganismenspezies nachzuweisen. Beispielsweise ermöglichen Multiplex-dPCR-Assays schnelle Tests auf bakterielle Pathogene, fungale Pathogene, virale Pathogene und verwandte Resistenzgene (16, 17, 18, 19, 20). Die berichteten Nachweissensitivitäten liegen bei nur 50 Kopieneinheiten pro ml, wobei eine Studie die Sensitivität der dPCR beim Nachweis von bakterieller DNA in Blut als 104-mal höher als die der qPCR berichtete (21).

In einer weiteren Publikation wurden Duplex-dPCR- und Duplex-qPCR-Assays entwickelt, um Cyanobakterien-Spezies in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die Autoren fanden heraus, dass die qPCR schnell und wirtschaftlich war, aber die dPCR eine höhere Genauigkeit, Präzision und Resistenz gegenüber PCR-Inhibition bot (22).

Inhibition und die Konkurrenz zwischen Targets sind eine wesentliche Herausforderung für die Multiplex-qPCR, besonders bei Umweltproben, in denen die Targets in geringen Mengen vorliegen und der Hintergrund aus Nicht-Target-DNA hoch ist. Multiplexing mit digitaler PCR ermöglicht nachweislich die genaue Quantifizierung von mindestens zwei Targets mit einem 1000-fachen Konzentrationsunterschied und liefert so eine praktikable Lösung für diese Grenzen der qPCR (22).

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Multiplex-dPCR-Assays in der Biopharma-Branche

In der Biopharma-Branche unterstützt dPCR-Multiplexing die Herstellungs- und Qualitätskontrollprozesse für monoklonale Antikörper (MABs), Impfstoffe, Zell- und Gentherapie sowie Biosimilars (23, 24, 25, 26). Multiplex-dPCR-Assays können zu mehreren Aspekten der Qualitätskontrolle beitragen, vom Nachweis von Kontaminanten bis zur Potenzquantifizierung. Die Methode macht eine effiziente Qualitätskontrolle möglich, da mehrere Kontaminanten gleichzeitig getestet werden können. 

Multiplexing mittels dPCR eignet sich gut für Applikationen, die eine genaue relative Quantifizierung eines Targets verglichen mit einem Haushaltsgen erfordern, oder wenn der Vektor, der entwickelt wird, mehrere therapeutische Gene und entweder ein Silencing-Gen oder eine Geneditierungsfunktion bereitstellt. Forschende, die mit Patientenmaterial arbeiten, können ebenfalls mehr Informationen aus einer einzelnen Probe gewinnen, sodass keine erneute Probennahme erforderlich ist und das Potenzial für menschliche Fehler sowie die Reagenzkosten pro Reaktion reduziert werden.

group of dividing cells

Überlegungen für die genaue Quantifizierung mittels digitaler Multiplex-PCR

  • Optimierung einzelner Assays: Validieren Sie Einzelreaktionen vor der dPCR-Multiplexierung (z. B. Überprüfung auf das Auftreten von Dimeren).
  • Prüfen von Primern und Sonden: Überprüfen Sie Ihre Primer und Sonden auf potenzielle Interaktionen.
  • Sorgfältige Auswahl von Farbstoffen: Wählen Sie die Farbstoffe für jeden Assay sorgfältig aus; wählen Sie für Targets mit niedriger Kopienzahl Farbstoffe mit hellem Fluorophor.
  • Überprüfung auf verknüpfte Targets: Untersuchen Sie das Potenzial für verknüpfte Targets oder Target-Korrelationen höherer Ordnung; verwenden Sie beispielsweise verknüpfungsbasierte Assays zur Messung der cis- versus trans-Konfiguration von Targets und potenzieller struktureller Umlagerungen.
  • Vermeidung von Kreuzhybridisierung: Designen Sie wenn möglich Sonde-zu-Target-Variationen, die zwei oder mehr Nukleotiddeletionen oder -insertionen umfassen, um Sonden-Fehlpaarungen zu vermeiden.
  • Minimierung von optischem Durchbluten: Tritt auf, wenn die Fluoreszenz eines Farbstoffs von mehr als einem Kanal erkannt wird; achten Sie wenn möglich darauf, dass Ihre konjugierten Farbstoffe zu den optischen Detektionssystemen passen, oder passen Sie die Signalverarbeitungsparameter in der Analysesoftware an.
  • Crosstalk-Probleme adressieren: Prüfen Sie, ob Ihr System über spezielle Softwarefunktionen wie z. B. eine anwenderdefinierte Crosstalk-Matrix verfügt, die helfen können, Crosstalk zwischen benachbarten Kanälen für alle Multiplex-Assays zu analysieren und somit die Zuverlässigkeit Ihrer Daten zu erhöhen
  • Reduzieren von Regen: „Regen“ beschreibt die Untergruppe der Partitionen, deren Signal höher ist als das der negativen, aber niedriger als das der positiven Partitionen. Sie können Regen reduzieren, indem Sie Ihren Template-Typ, die Konformation, die Integrität, die Assayspezifität und das Vorliegen von Inhibitoren in der Reaktion überprüfen. Erwägen Sie, den Schwellenwert anders zu positionieren, um eine Beeinflussung der Quantifizierung durch Regen zu vermeiden.
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Loslegen mit der Multiplex-dPCR

Wenn Sie an der Durchführung digitaler Multiplex-PCR interessiert sind, erwägen Sie die Investition in ein dPCR-Gerät mit fortgeschrittenen Multiplexingfähigkeiten. Es sind auch zahlreiche für digitale Multiplex-PCR-Assays entwickelte dPCR-Kits und dPCR-Assays verfügbar, die sowohl Einsteigerinnen und Einsteigern als auch Expertinnen und Experten auf dem Gebiet des Multiplexings viele Vorteile bieten können.

  • Ihr Gerät für die digitale PCR – Es gibt viele Arten von digitalen PCR-Systemen, aber einige bieten mehr Multiplexing-Optionen als andere. Mit dem QIAcuity dPCR System können Sie 8-plex-Assays durch Multiplexierung in bis zu sechs Standardkanälen und zwei Hybridkanälen für LSS-Farbstoffe ansetzen. Wenn Sie die Standardkanäle für das Amplituden-Multiplexing verwenden, können Sie die Multiplexing-Kapazität des QIAcuity auf 12-plex erweitern. 
Kanal  Anregung (nm)  Emission (nm)  Beispiel-Fluorophore

Green

463 – 503

519 – 549 

FAM™, EvaGreen®

Yellow 

513–534

551–565 

HEX™, VIC® 

Orange 

541–563

582–608

TAMRA™, Atto 550

Red 

568–594

613–655

ROX™, Texas Red®

Crimson 

588–638

656–694 

Cy5®, Quasar 680

Far red 

651-690

709-759

Cy5.5, Atto 680, Atto 700

Green / Yellow 

463–503

551–565

DY-482XL (LSS G/Y)*

Orange / Red 

541–563

613–655

DY-540XL (LSS O/R)*

  • Ihre vielseitig einsetzbaren dPCR-Kits – Verwenden Sie speziell für Multiplex-Reaktionen entwickelte dPCR-Kits. Das QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit ist ideal geeignet für schwierige Proben und das Multiplexing mit mehr als fünf Targets. Die QIAcuity Probe PCR Kits umfassen spezielle Master-Mixe zur Quantifizierung von bis zu fünf Targets mit stark unterschiedlicher Abundanz in einer QIAcuity Nanoplate. dPCR-Multiplexing spart Ihnen Zeit, Kosten und Probenmaterial, ohne die Qualität oder Validität der Daten zu beeinträchtigen.
  • dPCR-Kits für kontaminationsfreie Analysen – Es gibt spezialisierte Kits für Anwendungen, die ultrareine Master-Mixes zur Minimierung von kontaminierender Hintergrund-DNA erfordern. Das QIAcuity UCP Probe PCR Kit eignet sich ideal für die Analyse von Mikroorganismen oder für Qualitätskontrollapplikationen wie das Testen auf Rest-DNA. Die Kits bieten eine hohe Spezifität und Genauigkeit bei der Quantifizierung von gDNA oder cDNA in Singleplex- oder 5-plex-dPCR-Assays. 
  • Applikationsspezifische dPCR-Multiplex-Assays – Um für spezifische Applikationen den Durchsatz zu steigern und die Kosten zu senken, wurden dPCR-Assays mit verschiedenen Farbstoffen (FAM, HEX, ROX, Atto 500 und Cy5) entwickelt. Diese Multiplex-dPCR-Assays ermöglichen ein flexibles Versuchsdesign und die Multiplex-Analyse von bis zu fünf Targets in einer Reaktion. Es sind spezifische dPCR-Assays für CNV-Analysen, den Nachweis von Mikroorganismen, Zell- und Gentherapie sowie LNA-Mutationsassays für krebsassoziierte Mutationen verfügbar.

Vorgestellte Produkte für die digitale Multiplex-PCR

Publikationen mit dPCR-Multiplexing

Die wissenschaftliche Community hat sich die Vorzüge der dPCR-Multiplex-Assays vollständig zu eigen gemacht. Werfen Sie einen Blick auf eine ausgewählte Liste publizierter Forschender, die die digitale PCR mit Multiplexing-Ansatz nutzen:
Anwendung  Einsatz der Multiplex-dPCR  Literatur 

Untersuchung des antimikrobiellen
Potenzials von Hydrochinin und
Veränderungen der Genexpression,
die zu
Bakterienresistenz in P. aeruginosa beitragen können.

Multiplex-Reverse-Transkription-PCR
(mRT-dPCR) zur Überprüfung des Vorliegens
mehrerer mit Effluxpumpen assoziierter
Gene

Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T,
Baldock RA, Jongjitwimol J. Hydroquinine possesses
antibacterial activity, and at half the MIC, induces
the overexpression of RND-type efflux pumps using
multiplex digital PCR in Pseudomonas aeruginosa.
Tropical Medicine and Infectious Diseases. 2022;
7(8):156.
Identifizierung und Dekonvolution
von Gemischen von Spezies,
die üblicherweise in Haushalten vorkommen, für forensische
Zwecke 		 Identifizierten Homo sapiens, Hund, Katze,
Rind, Schwein, Fisch und Huhn in zwei
Multiplexen 		 Ghemrawi M and McCord B. Development
of a nanoplate-based digital PCR assay for species
identification with mixture deconvolution. Forensic
Science International: Genetics Supplement Series.
2022; 8:193–195. 
Nachweis von besorgniserregenden
SARS-CoV-2-Varianten in belgischem
zufließendem Abwasser 		 Targeted Multiplex-dPCR-Assay für den Nachweis
von vier verschiedenen besorgniserregenden Varianten (Variants of Concern, VOC)
und die Quantifizierung der RNA aus verschiedenen
SARS-CoV-2-VOCs in zufließendem Abwasser
 Booagaerts T et al. Optimization and application
of a multiplex digital PCR assay for the detection
of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian
influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. 
Nachweis von Genfusionen
anhand von RNA 		 Multiplexierte Primer in der initialen RT-PCR-Reaktion
unter Einsatz der ASPYRE-Technologie zur Identifizierung von
37 potenziellen Targets
innerhalb von 3‘-Genfusionsfamilien
 Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection
of gene fusions from RNA using ASPYRE. 
BMC Medical Genomics. 2022; 15:215.

Mehr Ressourcen zur Multiplex-dPCR

Weitere Literatur
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  3. Lee YM, Lee S, Kim HY. A multiplex PCR assay combined with capillary electrophoresis for the simultaneous identification of Atlantic cod, Pacific cod, blue whiting, haddock, and Alaska pollock. Foods. 2021; 10(11):2631.
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  5. Dobnik D, Spilsberg B, Bogožalec K, Holst-Jensen A and Žel J. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction. Analytical Chemistry. 2015; 87(16):8218–8226.
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