
Was ist digitale Multiplex-PCR?
Multiplexing bei der PCR ermöglicht den Nachweis von mehr als einem Target-Molekül oder mehr als einer Target-Sequenz in einer einzigen Reaktion. Multiplexing mit digitaler PCR (dPCR) kann durch Variation der Art der verwendeten Fluorophore erreicht werden. Bei dem traditionellen Mehrfarb-Multiplexing werden die Targets differenziert, indem eine Sonde je Target verwendet wird, die jeweils mit einem Farbstoff mit unterschiedlichem Emissionsspektrum konjugiert ist. Die meisten dPCR-Geräte ermöglichen den Nachweis verschiedener Fluorophore in mindestens zwei speziellen Detektionskanälen. Das QIAcuity Digital PCR System ermöglicht beispielsweise ein Multiplexing für die klare Unterscheidung von bis zu 12 Targets in derselben Reaktion.
Vorteile des dPCR-Multiplexings
Das Multiplexing bei der dPCR ist aufgrund der zahlreichen Vorteile des Multiplexings mit einem dPCR-System ein Thema von zunehmendem Interesse. Der Ansatz kann genutzt werden zur:
- Analyse mehrerer Targets in einer einzigen Reaktion
- Reduzierung technischer Fehler wie z. B. Ungenauigkeiten bei der Pipettierung
- Erhöhung der Wahrscheinlichkeit eines Target-Nachweises
- Reduzierung der benötigten Probenmenge für die Analyse
- Bereitstellung einer direkten internen Kontrolle einer Einzelreaktion
- Einsparung von Zeit und Reagenzien zur Senkung der Gesamtkosten
Multiplexing mit digitaler PCR ermöglicht mehrere Applikationen, die mit Single-Color-Assays nicht möglich oder nur schwierig durchzuführen sind. Einige dieser Analysen sind:
- Kopienzahlvarianten: Paarung von Target- und Referenzgenen zur Bestimmung ihres Verhältnisses mit einem Duplex-Verfahren
- Biallelische Variation von Einzelnukleotidvarianten oder kleinen Insertionen/Deletionen: Duplex-Verfahren mit zwei Hydrolysesonden, visualisiert anhand von Two-Color-Plots (1)
- Genotypisierung: Zählen der Partitionszahlen für einzeln und doppelt positive Cluster (1)
Ein digitales PCR-Gerät mit hoher Multiplexingleistung ermöglicht Ihnen die Analyse mehrerer Targets in einer Probe mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Das QIAcuity Digital PCR System beispielsweise ist in mehreren Konfigurationen verfügbar, um Ihren Anforderungen an die Proben- und Target-Analyse gerecht zu werden.
Der Vorteil von digitaler Nanoplatten-PCR für Multiplex-Reaktionen
Die digitale Multiplex-PCR ist eine bevorzugte Herangehensweise, da die Methode flexibler, sensitiver und spezifischer ist als die Multiplex-qPCR. Multiplexing mit qPCR kann außerdem kompliziertere Methoden zur Berechnung absoluter Werte erfordern, und die Methode ist anfälliger für Interferenzen zwischen mehreren PCRs in einer Reaktion. Mit Softwarefunktionen wie einer anwenderdefinierten Crosstalk-Matrix können Sie Crosstalksignale zwischen benachbarten Kanälen basierend auf Ihren Assay- und Laufparametern adressieren. Dies hilft, Ihre dPCR-Multiplex-Kapazität und Datengenauigkeit im Vergleich zur qPCR weiter zu verbessern.
Die digitale Nanoplatten-PCR bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Arten der digitalen PCR, wie kurze Laufzeiten, hohe Präzision und Sensitivität sowie Optionen für die Multiplexierung höherer Ordnung, einschließlich Amplituden-Multiplexing.
Das QIAcuity-Gerät bietet sechs Farben, die zum Nachweis von Targets in sechs Kanälen plus zwei Hybridkanälen verwendet werden können. Diese Hybridkanäle werden für Long Stokes Shift(LSS)-Farbstoffe verwendet. Wie funktionieren diese Farbstoffe? Die Spektralverschiebung zwischen dem absorbierten Licht und dem emittierten Licht ist in LSS-Farbstoffen im Vergleich zu Standard-Fluoreszenz-Farbstoffen größer. Das bedeutet, dass die Absorption und Emission auf verschiedenen Kanälen erfasst werden – z. B. erfolgt die Anregung mit der Wellenlänge des Standardkanals „Green“, die Emission/Bilderfassung wird jedoch mit dem Filter „Yellow“ durchgeführt. Dies ermöglicht die Analyse von bis zu 8-plex-Reaktionen.
Für noch mehr Targets können Sie die Multiplexierung höherer Ordnung ausprobieren. Mit der Möglichkeit zur Amplituden-Multiplexierung auf dem QIAcuity können Sie mit dem QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit bis zu 12 Targets analysieren. Bei der Amplituden-Multiplexierung werden gleichzeitig zwei Ziele im selben Farbkanal quantifiziert, was effektiv den Daten-Output pro Reaktion verdoppelt. Die QIAcuity-Software (ab Version 3.1) unterstützt die Amplituden-Multiplexierung durch Einführung von drei einstellbaren Schwellenwerten innerhalb des Kanals, um zwischen Target eins, Target zwei und Doppelt-Positiven zu unterscheiden. Mit diesen Schwellenwerten können Sie die Amplifikation jedes Targets in der Probe analysieren.
Fortschrittliche Optionen für Multiplexing höherer Ordnung optimieren Laborressourcen und liefern eine hochauflösende Darstellung genetischer Variationen. Diese Merkmale sind von grundlegender Bedeutung für Applikationen wie die Analyse von Kopienzahlvariationen und den Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere bei begrenzten Probenmengen.
Hauptmerkmale der QIAcuity-Familie
Hochdurchsatz- und Multiplexierungseigenschaften des QIAcuity* Digital PCR Systems für die nicht-klinische Forschung und des QIAcuityDx** Digital PCR Systems für die In-vitro-Diagnostik
QIAcuity* One 2plex | QIAcuity* One 5plex | QIAcuity* Four | QIAcuity* Eight | QIAcuityDx** Four | |
---|---|---|---|---|---|
Detektionskanäle | 2 | 8a (6+2 Hybridb) | 8a | 8a | 5 |
Multiplexing-Kapazität | 4 | 12c,a | 12c,a | 12c,a | 5 |
Anzahl der pro Arbeitstag | Bis zu 384 | Bis zu 384 | Bis zu 672 | Bis zu 1248 | Bis zu 672 (96 Well)d Bis zu 168 (24 Well) |
Zweck | Nicht-klinische Anwendungen | IVD-Anwendungen |
Sie haben weitere einführende Fragen zum dPCR-Multiplexing? Schauen Sie, ob unser QIAgenius sie beantworten kann:
Anwendungen der Multiplex-dPCR
Überlegungen für die genaue Quantifizierung mittels digitaler Multiplex-PCR
- Optimierung einzelner Assays: Validieren Sie Einzelreaktionen vor der dPCR-Multiplexierung (z. B. Überprüfung auf das Auftreten von Dimeren).
- Prüfen von Primern und Sonden: Überprüfen Sie Ihre Primer und Sonden auf potenzielle Interaktionen.
- Sorgfältige Auswahl von Farbstoffen: Wählen Sie die Farbstoffe für jeden Assay sorgfältig aus; wählen Sie für Targets mit niedriger Kopienzahl Farbstoffe mit hellem Fluorophor.
- Überprüfung auf verknüpfte Targets: Untersuchen Sie das Potenzial für verknüpfte Targets oder Target-Korrelationen höherer Ordnung; verwenden Sie beispielsweise verknüpfungsbasierte Assays zur Messung der cis- versus trans-Konfiguration von Targets und potenzieller struktureller Umlagerungen.
- Vermeidung von Kreuzhybridisierung: Designen Sie wenn möglich Sonde-zu-Target-Variationen, die zwei oder mehr Nukleotiddeletionen oder -insertionen umfassen, um Sonden-Fehlpaarungen zu vermeiden.
- Minimierung von optischem Durchbluten: Tritt auf, wenn die Fluoreszenz eines Farbstoffs von mehr als einem Kanal erkannt wird; achten Sie wenn möglich darauf, dass Ihre konjugierten Farbstoffe zu den optischen Detektionssystemen passen, oder passen Sie die Signalverarbeitungsparameter in der Analysesoftware an.
- Crosstalk-Probleme adressieren: Prüfen Sie, ob Ihr System über spezielle Softwarefunktionen wie z. B. eine anwenderdefinierte Crosstalk-Matrix verfügt, die helfen können, Crosstalk zwischen benachbarten Kanälen für alle Multiplex-Assays zu analysieren und somit die Zuverlässigkeit Ihrer Daten zu erhöhen
- Reduzieren von Regen: „Regen“ beschreibt die Untergruppe der Partitionen, deren Signal höher ist als das der negativen, aber niedriger als das der positiven Partitionen. Sie können Regen reduzieren, indem Sie Ihren Template-Typ, die Konformation, die Integrität, die Assayspezifität und das Vorliegen von Inhibitoren in der Reaktion überprüfen. Erwägen Sie, den Schwellenwert anders zu positionieren, um eine Beeinflussung der Quantifizierung durch Regen zu vermeiden.
Loslegen mit der Multiplex-dPCR
Wenn Sie an der Durchführung digitaler Multiplex-PCR interessiert sind, erwägen Sie die Investition in ein dPCR-Gerät mit fortgeschrittenen Multiplexingfähigkeiten. Es sind auch zahlreiche für digitale Multiplex-PCR-Assays entwickelte dPCR-Kits und dPCR-Assays verfügbar, die sowohl Einsteigerinnen und Einsteigern als auch Expertinnen und Experten auf dem Gebiet des Multiplexings viele Vorteile bieten können.
- Ihr Gerät für die digitale PCR – Es gibt viele Arten von digitalen PCR-Systemen, aber einige bieten mehr Multiplexing-Optionen als andere. Mit dem QIAcuity dPCR System können Sie 8-plex-Assays durch Multiplexierung in bis zu sechs Standardkanälen und zwei Hybridkanälen für LSS-Farbstoffe ansetzen. Wenn Sie die Standardkanäle für das Amplituden-Multiplexing verwenden, können Sie die Multiplexing-Kapazität des QIAcuity auf 12-plex erweitern.
Kanal | Anregung (nm) | Emission (nm) | Beispiel-Fluorophore |
---|---|---|---|
Green | 463 – 503 | 519 – 549 | FAM™, EvaGreen® |
Yellow | 513–534 | 551–565 | HEX™, VIC® |
Orange | 541–563 | 582–608 | TAMRA™, Atto 550 |
Red | 568–594 | 613–655 | ROX™, Texas Red® |
Crimson | 588–638 | 656–694 | Cy5®, Quasar 680 |
Far red | 651-690 | 709-759 | Cy5.5, Atto 680, Atto 700 |
Green / Yellow | 463–503 | 551–565 | DY-482XL (LSS G/Y)* |
Orange / Red | 541–563 | 613–655 | DY-540XL (LSS O/R)* |
- Ihre vielseitig einsetzbaren dPCR-Kits – Verwenden Sie speziell für Multiplex-Reaktionen entwickelte dPCR-Kits. Das QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit ist ideal geeignet für schwierige Proben und das Multiplexing mit mehr als fünf Targets. Die QIAcuity Probe PCR Kits umfassen spezielle Master-Mixe zur Quantifizierung von bis zu fünf Targets mit stark unterschiedlicher Abundanz in einer QIAcuity Nanoplate. dPCR-Multiplexing spart Ihnen Zeit, Kosten und Probenmaterial, ohne die Qualität oder Validität der Daten zu beeinträchtigen.
- dPCR-Kits für kontaminationsfreie Analysen – Es gibt spezialisierte Kits für Anwendungen, die ultrareine Master-Mixes zur Minimierung von kontaminierender Hintergrund-DNA erfordern. Das QIAcuity UCP Probe PCR Kit eignet sich ideal für die Analyse von Mikroorganismen oder für Qualitätskontrollapplikationen wie das Testen auf Rest-DNA. Die Kits bieten eine hohe Spezifität und Genauigkeit bei der Quantifizierung von gDNA oder cDNA in Singleplex- oder 5-plex-dPCR-Assays.
- Applikationsspezifische dPCR-Multiplex-Assays – Um für spezifische Applikationen den Durchsatz zu steigern und die Kosten zu senken, wurden dPCR-Assays mit verschiedenen Farbstoffen (FAM, HEX, ROX, Atto 500 und Cy5) entwickelt. Diese Multiplex-dPCR-Assays ermöglichen ein flexibles Versuchsdesign und die Multiplex-Analyse von bis zu fünf Targets in einer Reaktion. Es sind spezifische dPCR-Assays für CNV-Analysen, den Nachweis von Mikroorganismen, Zell- und Gentherapie sowie LNA-Mutationsassays für krebsassoziierte Mutationen verfügbar.
Vorgestellte Produkte für die digitale Multiplex-PCR
Publikationen mit dPCR-Multiplexing
Anwendung | Einsatz der Multiplex-dPCR | Literatur |
---|---|---|
Untersuchung des antimikrobiellen | Multiplex-Reverse-Transkription-PCR | Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T, |
Identifizierung und Dekonvolution von Gemischen von Spezies, die üblicherweise in Haushalten vorkommen, für forensische Zwecke | Identifizierten Homo sapiens, Hund, Katze, Rind, Schwein, Fisch und Huhn in zwei Multiplexen | Ghemrawi M and McCord B. Development of a nanoplate-based digital PCR assay for species identification with mixture deconvolution. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2022; 8:193–195. |
Nachweis von besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten in belgischem zufließendem Abwasser | Targeted Multiplex-dPCR-Assay für den Nachweis von vier verschiedenen besorgniserregenden Varianten (Variants of Concern, VOC) und die Quantifizierung der RNA aus verschiedenen SARS-CoV-2-VOCs in zufließendem Abwasser | Booagaerts T et al. Optimization and application of a multiplex digital PCR assay for the detection of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. |
Nachweis von Genfusionen anhand von RNA | Multiplexierte Primer in der initialen RT-PCR-Reaktion unter Einsatz der ASPYRE-Technologie zur Identifizierung von 37 potenziellen Targets innerhalb von 3‘-Genfusionsfamilien | Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection of gene fusions from RNA using ASPYRE. BMC Medical Genomics. 2022; 15:215. |
Mehr Ressourcen zur Multiplex-dPCR
Weitere Literatur
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