text.skipToContent text.skipToNavigation

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit

从细胞和有限的样本中同时扩增全基因组和全转录组
  • 同时扩增基因组DNA和RNA(总RNA或富集mRNA)
  • 基因组状态与转录模式轻松关联
  • MDA技术实现了无偏差的扩增
  • 直接从细胞或组织中扩增gDNA和RNA
  • 适用于包括NGS在内的所有下游应用
REPLI-G Cell WGA & WTA Kit是唯一能够同时均一地扩增全基因组扩增和全转录组的产品,并且使得基因组与来源于非常小量样本(25–1000个细胞)的转录组具有直接相关性。专用的缓冲液和试剂经过独特的、可控的净化步骤处理,避免REPLI-g扩增污染核酸。创新的裂解液可以有效地稳定细胞核酸,从而确保基因组DNA和RNA水平准确表现。基因组DNA和总RNA或mRNA(poly A +)的无偏差扩增采用创新的多重置换扩增(MDA)技术和新颖的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶来实现。不同于基于PCR的扩增技术,MDA具有增加高达1000倍的高保真率,避免了假阳性或阴性结果出现。
Cat No./ID: 150052
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (12)
REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for parallel 12 x 60 µl whole genome amplification reactions and 12 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg from each reaction)
Cat No./ID: 150054
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (48)
REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for parallel 48 x 60 µl whole genome amplification reactions and 48 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg from each reaction)

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
REPLI-g技术扩增的cDNA在下游实验中与gDNA的表现相当。
REPLI-g Kits可以扩增各种来源和样品类型的基因组DNA或RNA,产生可像gDNA一样处理的扩增DNA和cDNA,非常适合于众多的下游实验。
1
多重置换扩增技术。
引物(箭头)退火到模板DNA,并在30℃下通过REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶沿着cDNA模板链延展,置换互补链成为复制模板。与基于PCR的扩增不同,MDA不需要温度变化,并且扩增结束于具有低突变率的长片段。
2
实验可重复性高,信号噪声小。
使用REPLI-g Cell WGA&WTA Kit的全转录本扩增(WTA)在操作上使用mRNA(poly A +)富集实验方法,以减少rRNA的扩增。利用WTA技术扩增的cDNA被片段化(Covaris S220),并使用GeneRead Library Prep I Kit制备了一个NGS测序文库。测序在一台MiSeq Instrument (Illumina) 上完成,RNA的生物型检测则采用Bowtie2,并且对每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(RPKM)进行了计算。结果相当,R2值为0.91,为25个细胞样本的RPKM值相对于源于所有WTA样本测试的平均值(25、50、或100个细胞的5个样本)的比值。
3
十分适合于利用有限的样本同时进行基因组合转录组分析。
使用REPLI-g Cell WGA & WTA Kit从相同的25个细胞样本扩增DNA和总RNA。我们采用相同的RT2 Profiler PCR Array分析62个个体基因和它们相应的转录物,并按照它们的表达水平进行排序。来源于基因组DNA的所有基因检测到的CT水平在20–30之间,对应的转录物则由于不同的丰度(包括检测不到的转录物水平)而显示出差异。
4
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit实验流程。
在5分钟内有效地裂解单一细胞样品(含有1–1000个细胞),且保持RNA或DNA的完整性。细胞裂解后,在WTA操作前除去gDNA。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有的转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集)或仅多聚腺苷酸转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ mRNA富集)将会被扩增。合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。连接后的cDNA随后被扩增,并结合MDA技术与新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,恒温反应2小时。
Performance
完整覆盖基因组和转录组,实验可靠
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,以及用于从25–1000个细胞或相当量的样本中同时扩增全基因组扩增和全转录组的优化缓冲液和试剂。经过高效的细胞裂解后,(彻底去除基因组DNA,之后进行灵敏的逆转录),该试剂盒采用多重置换扩增(MDA)技术完整地、无偏差地扩增基因组DNA和cDNA(参见Multiple Displacement Amplification (MDA) technology)。扩增的gDNA和cDNA可以在各种下游应用中使用(参见REPLI-g amplified cDNA and gDNA perform like gDNA in downstream experiments)。

适用于多种研究领域
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit 可以直接从细胞中有效扩增gDNA和cDNA,并且可以与经常在临床研究分析中出现的各种样本一起使用,包括肿瘤细胞、干细胞、分选细胞或其它小量样本(参见下表)。

样本材料和研究领域的广泛性
样本材料(细胞或总RNA) 研究领域
癌症 体细胞遗传变异分析
肿瘤恶化
肿瘤干细胞/进化
肿瘤的异质性
体细胞遗传变异分析
人/动物 生物标记物研究(SNP、突变、CNV)
嵌合体的研究
干细胞研究
遗传易感性研究
Principle
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit专门用来从少量样本中同时扩增基因组DNA和总RNA,可实现基因组与转录组直接关联。转录调节受基因组对环境的反应所驱动。基因组中的突变和变异,例如点突变和拷贝数或结构的变化,会导致各种物种内或生物体内(例如,嵌合体组织和癌症)形成不同基因组。部分基因组变异可能对细胞或机体调节具有较低影响力。其他变异则可能对转录调节具有很大的影响并最终反映到生理机能上。由于组织的复合结构,对转录本基因型变化的直接结果分析只能通过那些由相同细胞组成的非常小量的样本进行。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit可以对整个基因组和转录组进行高度均一的扩增,并且序列偏差可以忽略不计。本试剂采用多重置换扩增(MDA)技术,该技术利用一种可复制高达70 kb的片段而无需解离DNA模板的独特的、连续DNA聚合酶进行gDNA/cDNA恒温扩增(参见Multiple Displacement Amplification (MDA) technology)。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit独特的构成
  • 所有的试剂酶和扩增组分都经过独特的、可控的净化步骤处理,以确保消除REPLI-g扩增污染DNA或RNA。之后则对试剂进行严格的质量控制,以确保其具有完整的功能。
  • 独特的裂解液可以有效地稳定细胞RNA和DNA。这确保了所产生的RNA能准确地反映体内基因表达图谱,同时保持RNA和DNA的完整性,以便进行最大覆盖度的基因组分析。
  • 所有的酶促步骤已经过专门开发,能够有效地处理RNA或DNA,从而准确地扩增。例如,这些步骤中包括了在合成RNA扩增所需的cDNA之前有效去除gDNA,以及确保DNA有效扩增的酶促DNA制备。
  • 新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase可以用于多重置换扩增。它是新开发的高亲和力酶,可以更有效地结合DNA,特别是在DNA浓度在反应混合物中较低时。此外,对比基于PCR的方法,REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase具有较强的校对活性,可以将错配率减少1000倍。它还具有很强的链置换活性,通过稳定的发夹结构使DNA得以复制,该结构对以Taq酶为基础的全基因组和全转录本扩增步骤具有抗性。
 
Procedure
遗传分析往往需要大量的gDNA和cDNA,这对经常遇到的样本量少是个挑战。无法对少量样本进行基因组状态和转录模式相关性分析。全基因组扩增和全转录组的同时扩增可以克服DNA或RNA量少的限制,可对一个只含有少量细胞的样本进行分析。简单的反应设置,合理而简单的处理步骤,处理时间只需20分钟,完整的gDNA和RNA同时扩增总反应时间只有4小时,这使得REPLI-g Cell WGA & WTA Kit的操作步骤简单和可靠。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂(参见REPLI-g Cell WGA & WTA Kit procedure):

  • 细胞裂解:在5分钟内将样本(含有25–1000个细胞)有效地裂解,同时保持RNA或DNA的完整性。裂解的细胞被分为相等体积的两等份。第一等份试样用于WGA,而第二等份试样用于总RNA的WTA,或富集mRNA(poly A +)RNA。
  • 全基因组扩增 :细胞裂解之后,一等份试样中的DNA被修饰用于高效的连接反应。由于该连接反应的性质,DNA片段并未按照它们原本存在于生物体中的顺序组装。然而,这并不影响下游应用中的核酸序列检测(例如,基因多态性),例如NGS、芯片分析或者qPCR。连接反应后,使用MDA技术和新颖的、高亲和力REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase进行扩增。
  • 全转录本扩增:细胞裂解后,在开始WTA处理之前,gDNA被从第二等份试样中去除,这是由于转录水平的精确测量依赖于能否消除gDNA污染所造成的假阳性结果。然后利用高效率的连接反应与扩增反应制备cDNA。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有总RNA富集的转录物或只有poly A+ mRNA富集的多聚腺苷酸转录物将会被扩增。
Applications
REPLI-g Cell WGA & WTA Kit允许从一个非常小量的样本开始对全部转录物和基因组进行均一的平行扩增。利用该试剂进行的gDNA和cDNA平行扩增非常适用于二代测序技术(包括DNA-Seq和RNA-Seq*)、芯片分析、基因分型检测应用、或定量PCR。

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit适用于扩增:

转录组(RNA):
  • 带有poly A+尾巴的mRNA
  • 总RNA
  • RNA转录本的所有片段
  • mRNA的3’端
  • Lnc和linc RNAs
基因组(DNA):
  • 基因组DNA
  • 线粒体DNA
不适用于小核酸(例如)
  • tRNAs和miRNAs
  • 高度降解的DNA或RNA

  • * 如果要进行二代测序,则应了解超过90%的片段来自于rRNA;因此,转录组测序前必须进行总RNA扩增。如扩增富集mRNA(poly A +)RNA时省略反应中的随机引物,rRNA的扩增反应则不会发生。