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exoEasy Maxi Kit

从血浆、血清及细胞培养上清中纯化外泌小体及其他细胞外囊泡(EV)
  • 可分离获得完整的exosome及其他细胞外囊泡
  • 适用于功能性检测及物理和生化分析
  • 可在25分钟内纯化获得exosome及其他细胞外囊泡
  • 可通过简单的离心柱实验方案平行处理多个样品
  • 可提取高达4 ml的血浆或血清,或者32 ml的细胞培养上清
exoEasy Maxi Kit使用了膜亲和离心柱来高效地从血浆、血清、细胞培养上清及其他生物液体中提取获得exosome及其他细胞外囊泡。Maxi规格的离心柱可允许处理大体积的样品,包括高达4 ml的血浆或血清,或者32 ml的细胞培养上清。实验流程非常快速一致,非常适用于提取EV进行exosome及其他细胞外囊泡的功能性分析。
Cat No./ID: 76064
exoEasy Maxi Kit (20)
For 20 vesicle preps: 20 exoEasy Maxi Spin Columns, Collection Tubes (50 ml), Reagents and Buffers
Cat No./ID: 76204
Buffer XBP (250 ml)
250 ml Binding Buffer

exoEasy Maxi Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


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exoEasy膜上结合的囊泡完整,且比超速离心法具有更高纯度。
使用扫描电镜(SEM;20000倍放大倍率)观察并对比:预过滤血浆(0.8 µm)超速离心得到的可溶性沉淀,以及从exoEasy纯化柱洗脱的未裂解洗脱液。两种制备方法的产物都含有囊泡状结构,这些结构的预期大小为50–200 nm(白色箭头,比例尺为200 nm)。超速离心法的产物还含有很多较小的不可识别结构,与细胞外囊泡的预期形状和大小不同。
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exoEasy Maxi Kit - 25分钟内完成外泌小体纯化。
exoEasy Maxi Kit可从预过滤的血清、血浆或细胞培养上清中在25分钟内提取获得细胞外囊泡。洗脱下来的囊泡可即用于物理或生化性质分析,或可进行缓冲液交换及浓缩,可使用如超滤技术等方法。
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对使用exoEasy Maxi Kit提取获得的细胞外囊泡使用NTA方法进行性质分析。
(A) 在无血清培养基中对HeLa细胞进行48小时培养,然后收集培养上清。使用exoEasy Maxi Kit从2 ml使用了0.8µm滤器进行预过滤的上清中提取EV。将EV进行1:100稀释,并使用Nanosight NS300仪器(Malvern, UK)进行性质分析。(B)从1 ml EDTA血浆中提取获得EV(以1:200的稀释倍数进行检测)。微粒的平均直径分别为212 nm和214 nm,为exosome和其他细胞内囊泡的预期大小。红线表示五次重复测量的差别。
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使用exoEasy Kit分离的外囊泡被靶细胞有效吸收(客户数据)。
HEK 293T细胞在不含细胞囊泡的DMEM中培养66个小时。使用exoEasy Kit从过滤过的15 ml细胞培养悬浮液中分离细胞外囊泡。使用Nanosight仪器测量颗粒浓度。使用BODIPY TR Ceramide在37°C下标记分离的EV。未结合的染料通过层析(SEC)去除。作为阴性对照,将等量不含染料的PBS溶液也进行同样的SEC层析。为检测靶细胞吸收的EV,将大约1.5 x 109的标记颗粒与2 x 104的HEK 293T细胞在200 µl DMEM 37°C中孵育1小时。洗涤后,有DAPI染色的细胞有显色(底部一行),上部一行为被细胞吸收的EV。左侧列为阴性对照,右侧列为标记的EV。
Performance
用于纯化外泌小体及其他细胞外囊泡的exoEasy实验方案不仅比超速离心更加快捷,而且可获得更洁净的纯化产物。扫描电子显微镜显示两种技术均可提供完整的预期尺寸的囊泡,不过通过超速离心法制得的样品中还含有一些并不符合EV尺寸或外形的更小的结构。

提取获得的囊泡具有完整的功能,可用于多种下游应用,包括细胞培养等工作。洗脱的囊泡的性质和数量可通过多种不同的方法进行测定。其中包括电子显微镜、物理特征描述(例如,纳米颗粒追踪分析(NTA),或可调电阻脉冲感应(TRPS))、微粒分子成分分析(例如蛋白质、核酸或脂类)等。由于如NTA或TRPS等微粒计数方法无法将囊泡与其他悬浮颗粒区分开,使用未经处理的生物液体或仍含有其他颗粒物(例如,蛋白复合物)的粗制备样品进行颗粒计数可能会明显地高估囊泡数目。
Principle
exoEasy Kit在传统的超速离心exosome或微泡提取方法的基础上进行了改进,可在25分钟内获得纯化的细胞外囊泡。
  
exoEasy Maxi Kit使用了膜亲和结合步骤来从血浆、及血清或细胞培养上清中分离exosome及其他EV。这种方法无法通过大小或细胞来源对EV进行区分,也不依赖于是否存在微粒表位。它运用了囊泡的通用生化特性来提取样品中的所有细胞外囊泡(参见图片使用NTA对由exoEasy Maxi Kit提取获得的细胞外囊泡进行性质分析)。因此,必须完全去除细胞、细胞碎片、凋亡小体等组分,可在开始提取步骤前对样品进行离心或过滤等操作。

Exosome Diagnostics, Inc.开发的技术使用了离心柱及专门的缓冲液来从预过滤的生物液体中纯化exosome;可处理高达4 ml的血浆或血清。对于细胞培养上清,经试验验证可从高达32 ml的样品中成功提取外泌小体(4次离心柱上样步骤)。不过,上清中的囊泡浓度非常依赖于细胞类型及培养条件;因此我们建议,对于未经过该试剂盒测试样品材料,起始上清体积不要超过16 ml。更高的样品体积可能导致囊泡的回收率降低。实验流程非常快速一致,非常适用于exosome及其他细胞外囊泡的功能性分析。除囊泡之外的悬浮颗粒绝大部分可在结合及清洗步骤中被去除,这种颗粒包括了大体积的蛋白复合物,其在血浆及血清中含量很高。
Procedure
提取细胞外囊泡的总流程仅需要25分钟。将预先过滤过的血浆、血清或细胞培养上清(去除了尺寸大于0.8 μm的颗粒)与Buffer XBP进行混合并结合在exoEasy膜亲和离心柱上。对结合的外泌小体使用Buffer XWP进行清洗,并随后使用400 µl Buffer XE(主要含无机盐的水缓冲液)进行洗脱,随后即可用于物理或生化分析。对于特定应用,如生物检测等,可能需要进行额外的浓缩或缓冲液置换步骤。此步骤可通过孔径尺寸为100 kDa或更小的超滤方法来实现。
Applications
exoEasy Kit非常适合于从血浆、血清、细胞培养上清及其他生物液体中提取微囊泡。提取获得的囊泡可用于如下应用进行分析:

• 物理性质分析(例如,NTA,TRPS)
• 电子显微镜
• 提取并分析DNA、RNA*、蛋白质、脂类及其他成分
• 流式细胞术
• 抗体或荧光染料标记
• 受体细胞的摄取

*如需提取囊泡RNA,我们推荐使用exoRNeasy试剂盒。

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参考文献
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