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TAGZyme pQE Vector Set

表达通过TAGZyme酶去除His标签的重组蛋白

  • 通过TAGZyme酶可去除表达的His标签
  • 高效表达N端His标签蛋白
  • 表达水平占总胞内蛋白高至50%
两种TAGZyme pQE载体都能编码N端带6xHis标签蛋白,并含有能被DAPase消化的序列,具有很高的蛋白表达水平。对于自身不含有DAPase终止位点的蛋白,TAGZyme pQE-1能在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基,在过量Qcyclase酶作用下变为焦谷氨酸,形成DAPase终止位点。使用TAGZyme pQE-2载体表达自身含有终止位点的重组蛋白,不管DNA片段插入位点如何,都可完全、有效地去除N端标签。两种载体都含有氨苄青霉素抗性基因、一个Col E1复制起点、一个T5启动子、lac操纵子和核糖体结合位点。pQE-2还带laclq阻遏基因。
Cat No./ID: 32932
TAGZyme pQE Vector Set
TAGZyme pQE-1 and pQE-2 Vector DNA, 25 µg each

TAGZyme pQE Vector Set适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


2
TAGZyme pQE-1和pQE-2载体的特点。
ATG: 启动子;6xHis: 6xHis标签序列;MCS: 多克隆位点;Stop Codons: 在所有3个阅读框内。
Performance
TAGZyme DAPase Enzyme可有效去除His标签N端到“终止位点”间的肽,蛋白可由TAGZyme pQE载体表达(参见"Efficient His-tag removal")。当谷氨酰胺残基作为终止位点时,可被DAPase-Qcyclase和pGAPase的共同作用去除。通过消减IMAC可从反应液中获得真正的目的蛋白。由于TAGZyme DAPase Enzyme、Qcyclase和pGAPase 酶自身C 端带有6xHis标签,它们和未处理的His-tagged重组蛋白能被有效去除。
Principle

His-tagged重组蛋白是研究蛋白结构和功能的重要工具。His标签很小并具有较低的免疫原性,使它通常不需要被去除。但是,不含有载体来源氨基酸的蛋白产物更适用于一些应用,例如通过X射线或NMR进行结构研究,或生产具有治疗效果的药物。

TAGZyme pQE载体都含有多克隆位点,用于表达能被DAPase消化的N端6xHis-tagged蛋白(参见"Features of the TAGZyme pQE-1 and pQE-2 vectors")。T5-启动子转录-翻译体系在E. coli中有很高表达水平。TAGZyme pQE-2载体适用于表达自身不含有DAPase终止位点的蛋白。表达不含有终止位点的蛋白,使用TAGZyme pQE-1载体可在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基,在过量Qcyclase酶作用下变为焦谷氨酸,形成DAPase终止位点。

TAGZyme体系从重组蛋白上去除N端His标签,具有很高的特异性和效率。DAPase,酶用于切割纯化His-tagged蛋白N端肽(参见"His-tag removal")。当酶切割到“终止位点”时,消化就会停止,终止位点是一个不能作为底物的氨基酸基序(见表“DAPase终止位点”)。如果重组蛋白自身不含有DAPase终止位点,可通过在载体上插入谷氨酰胺密码子来引入。在表达的蛋白中,谷氨酰胺变成焦谷氨酸,成为DAPase酶的终止位点。

DAPase 终止位点
氨基酸 DAPase 终止位点 (↓) 序列*
 赖氨酸 (Lys, K)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa Lys-Xaa...
 精氨酸 (Arg, R)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Arg-Xaa...
 脯氨酸 (Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Xaa-Pro-Xaa...
 脯氨酸 (Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Pro-Xaa-Xaa...
 谷氨酰胺 (Gln, Q)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Gln-Xaa...
 异亮氨酸 (Ile, I)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Ile-Xaa-Xaa...
*天然的DAPase终止位点(↓)是二肽内指定位点紧接的氨基酸(被切掉的二肽标有下划线)。
† 在过量Qcyclase。Enzym存在条件下,谷氨酰胺残基变为焦谷氨酸。
Procedure

使用TAGZyme pQE-2载体表达自身含有终止位点的重组蛋白,不管DNA片段插入位点如何,都可完全、有效地去除N端His标签。使用DAPase酶孵育后,反应液加入到Ni-NTA基质中进行消减固定金属亲和层析色谱(IMAC)(参见"Purification of detagged proteins")。His标签片段和TAGZyme DAPase酶(C 端带有未切割的His标签)与基质结合,在穿透液中可回收到纯化的、无标签的目的蛋白。

当蛋白自身不含有DAPase终止位点时,可通过表达载体插入谷氨酰胺密码子,从而向蛋白序列中引入终止位点。TAGZyme pQE-1载体可在6xHis标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基,可配合TAGZyme体系发挥作用。谷氨酰胺残基位于His标签后的奇数位位点,正好在原始蛋白第一个氨基酸之前。使用DAPase酶和过量的Qcyclase酶可去除His标签。通过DAPase酶去除His标签肽后,谷氨酰胺残基暴露在N端。反应液中过量的Qcyclase酶能将N端的谷氨酰胺残基催化形成焦谷氨酸。N端含有焦谷氨酸的肽不能作为DAPase的底物,进一步的切割就被终止了。反应液进行一轮消减IMAC,His-tagged TAGZyme DAPase和Qcyclase Enzymes就能被去除。在穿透液中可收集到目的蛋白。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基可被6xHis-tagged pGAPase酶去除,pGAPase酶能被第二轮消减IMAC去除,在穿透液中即可获得纯化的、无标签的目的蛋白。

Applications

TAGZyme体系提供特异性切割,重组试剂的使用以及完全去除污染物,使其成为获得不含His标签蛋白的理想选择,适合的应用包括:

  • 通过NMR或X射线结晶确定蛋白结构
  • 生产具有治疗功能的蛋白
Features
Specifications
三个阅读框 No
表达 In vivo
表达物种 E. coli
需要框内克隆 Yes
N或C末端标签 No tag
标签 6xHis tag
标签去除序列 TAGZyme System necessary
fragment fix placeholder