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REPLI-g WTA Single Cell Kit

从单细胞起始的总RNA或mRNA全转录本扩增
  • 从单一细胞实现完整的转录本覆盖度
  • MDA技术可实现均一的WTA,序列偏差可以忽略不计
  • 针对新技术应用(包括NGS)优化
  • 总RNA或富集mRNA(ploy A +)RNA的扩增
  • 用于癌症和干细胞研究的新工具
REPLI-g WTA Single Cell Kit能够在单细胞转录本水平上对转录调控的影响进行可靠的研究,并允许从单细胞(1–1000个细胞)进行所有转录物的均一扩增。专用的缓冲液和试剂经过了独特的、可控的净化步骤以防止REPLI-g技术扩增污染的核酸。创新的裂解液可以有效地稳定细胞RNA,以确保所得到的RNA准确地反映体内基因的表达图谱。所有的酶促步骤已经过专门改进,使得用于cDNA准确扩增的RNA得到高效处理。而扩增步骤则采用创新的多重置换扩增(MDA)技术,序列偏差可以忽略不计。
Cat No./ID: 150063
REPLI-g WTA Single Cell Kit (24)
REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 24 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg)
Cat No./ID: 150065
REPLI-g WTA Single Cell Kit (96)
REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 96 x 60 µl whole transcriptome amplification reactions (typical yield: 20 µg)

REPLI-g WTA Single Cell Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
对3个细胞进行的检测结果于大量细胞的结果相当。
REPLI-G WTA单细胞反应在3–1000个细胞上重复进行,并使用mRNA(poly A +)富集实验方法以减少rRNA 的扩增。WTA扩增的cDNA被片段化(Covaris S220),而一个NGS测序文库则使用GeneRead Library Prep I Kit制备。测序在一台MiSeq Instrument (Illumina)上完成,RNA的生物型位置测定则采用Bowtie2。结果表明,大部分的片段(> 80%)可对蛋白质编码RNA和Linc RNA进行位置测定,而其他位置测得非靶向RNA生物型(少数RNA生物型数据未显示)片段的数量则可以忽略。获得的所有WTA样品(平均值[全细胞])和3个细胞WTA样品(平均值[3细胞])的测序值结果相当。
1
实验的可重复性高。
[A] REPLI-G WTA单细胞反应使用了mRNA(poly A +)富集实验方案来减少rRNA的扩增。通过WTA扩增制备cDNA,并在MiSeq Instrument (Illumina)上进行测序。通过使用Bowtie2,RNA的生物型定位于单一转录本RNA,并计算每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的读段数目(RPKM)。结果证明,来源于3个细胞样品与来源于WTA样品(10–50细胞)的转录物平均RPKM值相当。[B] REPLI-g WTA单细胞反应(包括rRNA的扩增)在单个人类细胞上进行。各种转录物(18S rRNA、28S rRNA、ddx5、beta-actin、HPRT、GAPDH、PPIA、c-myc、RPS27a、BANF-1、ABL-1)的real-time PCR使用QuantiFast SYBR Green PCR试剂和1 ng WTA-cDNA完成。来源于两个独立单细胞WTA反应的CT值针对18S rRNA归一化的结果证明,不同实验的RNA扩增高度一致,R2值> 0.97。
2
高度灵敏的检测单细胞中的低丰度转录本。
使用REPLI-g WTA Single Cell Kit对15个不同的单细胞或10 pg的总RNA的复制子进行全转录本扩增。对来源于各种不同转录物的1 ng WTA扩增的DNA进行Real-time PCR分析,以定量检测转录水平(高、中、低)。[A] 从ΔCT (CT [WTA-DNA] –平均CT [WTA-DNA])计算得到的盒状图用以区分方法衍生技术噪声方面的生物学差异。绿色框图表示基因表达增加,红色盒表示基因表达相比于平均值降低。技术噪点由白框表示,这显然小于检测到的生物学上差异。[B] 15个细胞上一种低拷贝转录物(ABL-1)的分析证明,在个体细胞之间转录水平存在差异,且大多数CT值落在技术噪点之外(由黑线表示)。这些结果表明,REPLI-g WTA Single Cell Kit非常适合分析来源于单细胞的低丰度转录物。
3
对低丰度转录本进行更加灵敏的检测。
使用20 pg总RNA进行全转录本扩增。[A] 其他厂商的试剂在扩增同样数量的相同转录物时往往不太成功,与之不同的是REPLI-g WTA Single Cell Kit扩增的RNA可以检测到100%的高、中、低丰度的转录物。[B] 22个中等丰度转录物代表着[A]中中等丰度转录物行,对其进行real–time PCR发现,只有REPLI-g WTA Single Cell Kit可靠扩增了所有的转录物。不能被检测到的转录物的CT值> 40(红色条)。
4
REPLI-g amplified cDNA performs like gDNA in downstream experiments.
REPLI-g Kits amplify genomic DNA or RNA from a wide variety of sample types, generating amplified DNA and cDNA that performs just like gDNA and is highly suited for numerous downstream experiments.
5
Multiple Displacement Amplification (MDA) technology.
Primers (arrows) anneal to the template DNA and are extended at 30ºC by REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase, which moves along the cDNA template strand, displacing the complementary strand while becoming a template itself for replication. In contrast to PCR-based amplification, MDA does not require different temperatures and ends in very long fragments with low mutation rates.
6
REPLI-g WTA Single Cell Kit实验流程。
在5分钟内有效地裂解单一细胞样品(含有1–1000个细胞),且保持RNA或DNA的完整性。细胞裂解后,在WTA操作前除去gDNA。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有的转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集)或仅多聚腺苷酸转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ mRNA富集)将会被扩增。合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。连接后的cDNA随后被扩增,并结合MDA技术与新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,恒温反应2小时。
Performance
覆盖全转录组,实验可重复性高
REPLI-g WTA Single Cell Kit包含新颖的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶,以及从1–1000个细胞或等量的小量样本进行全转录本扩增(WTA)的优化缓冲液和试剂。高效裂解细胞、彻底清除基因组DNA(gDNA)和敏感的逆转录物之后,采用多重置换扩增(MDA)技术,以可以忽略的序列偏差对整个转录本均一地扩增cDNA(参见Multiple Displacement Amplification (MDA) technology)。使用REPLI-g WTA Single Cell Kit扩增的cDNA,经证明在二代测序技术(NGS)和real-time PCR应用中具有各细胞间和各次实验间的高度可重复性(参见High level of experimental reproducibility)。扩增的cDNA可以轻松地应用于各种下游应用(参见REPLI-g amplified cDNA performs like gDNA in downstream experiments)。

蛋白编码RNA的数量多
扩增富集mRNA的RNA (poly A+)的能力,使REPLI-g WTA Single Cell Kit特别适用于通过NGS研究单细胞转录本水平上的转录调控影响。产生超过90%的NGS片段的核糖体RNA(rRNA)扩增几乎完全被消除,可产生有意义的mRNA-Seq数据。使用mRNA富集实验方法的WTA后,80%以上的读段可以用于定位蛋白编码RNA(参见High number of mappable reads from just 3 cells)。

可靠检测低丰度转录本
单细胞分析的挑战性大,尤其是同一细胞内的转录本丰度差异很大时。为获得准确的结果,应确保全转录组扩增时可靠扩增所有转录本。REPLI-g WTA Single Cell Kit高度适合于但细胞中转录本分析,即便是低丰度转录本。对使用REPLI-g技术扩增的转录本abl-1进行real-time PCR分析,结果显示即便是低丰度转录本也能在使用该试剂盒扩增后,得以可靠的检测(参见Reliable detection of even low-abundance transcripts from single cells)。

多种研究领域的应用
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从单细胞(如肿瘤细胞、干细胞或分选细胞)有效地扩增获得cDNA,并从纯化的总RNA或poly A+ RNA(10 pg–100 ng)生成和扩增cDNA,适合于广泛的研究领域(参见下表)。

样本类型和研究领域
样本材料(细胞/总RNA) 研究领域
人类/动物 生物标记物的研究(表达)
干细胞研究
游离胚胎细胞分析
嵌合体研究
遗传易感性研究
转基因动物基因分型
癌症
体细胞遗传变异分析
肿瘤恶化
肿瘤干细胞/演化
游离肿瘤细胞分析

Principle
转录调节受到各种因素驱动,如应激、细胞环境或由疾病或体细胞基因组变异(例如,点突变、拷贝数变异或结构变化)等。此外,如可变剪接等转录后加工,导致转录模式不同并最终造成生理机能的不同。由于组织的复合结构,在单细胞中对转录调控进行研究,而不是分析大量的细胞并且立足分析结果解释他们的行为,正不断引起科学家们的兴趣。

REPLI-g WTA Single Cell Kit经过特别设计,能在单细胞转录水平上可靠地研究转录调节的影响。它可以对整个转录本进行高度均一的扩增,并且序列偏差可以忽略不计。REPLI‑g WTA Single Cell Kit提供的单细胞全转录本扩增是对全基因组扩增试剂(REPLI-g Single Cell Kit)的相应补充。本方法基于MDA技术,该技术利用能够复制可达70 kb而无需解离cDNA模板的一种独特的、连续性DNA聚合酶进行cDNA恒温扩增(参见Multiple Displacement Amplification (MDA) technology)。
REPLI-g WTA Single Cell Kit独特的构成
  • 所有的试剂酶和扩增组分都经过了独特的、可控的净化步骤以确保消除被REPLI-g方法扩增的DNA或RNA污染。下面的步骤则是对试剂进行严格的质量控制,以确保其具有完整的功能。
  • 独特的裂解缓冲液可以有效地稳定细胞RNA和DNA。这确保了所产生的RNA能准确地反映体内基因表达图谱,以及RNA和DNA保持完整无缺,用于随后的基因组覆盖范围最大化分析。
  • 所有的酶促步骤已经过专门改进,使RNA或DNA的扩增准确而有效。例如,这些步骤包括在用于RNA扩增的cDNA合成之前有效的去除gDNA以及确保DNA有效扩增的酶解DNA制备。
  • 新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase可以用于多重置换扩增(MDA)。它是新开发的高亲和力酶,可以更有效地结合DNA,特别是当DNA浓度在反应混合物中较低时。此外,对比基于PCR的方法,REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase具有较强的校对活性,可以将错误减少1000倍。它还具有很强的链置换活性,通过稳定的发夹结构使DNA得以复制,该结构对以Taq酶为基础的全基因组和全转录扩增步骤具有抗性。
Procedure
基因分析往往需要大量的cDNA。全转录本扩增克服了RNA数量少的限制,可以对小数量的细胞甚至单个细胞进行分析。最简单的反应设置,最简单的反应设置,合理而简单的处理步骤,处理时间只需20分钟,完整的gDNA和RNA平行扩增总反应时间只有4小时,这使得REPLI-g Cell WGA & WTA Kit的操作步骤变得简单和可靠。 

REPLI-g Cell WGA & WTA Kit包含用于以下反应的试剂(参见REPLI-g WTA Single Cell Kit procedure):
  • 细胞裂解:单一细胞样品(含有1-1000个细胞)在5分钟内有效地裂解,对RNA的完整性没有影响。裂解的样品用于总RNA的WTA,或可选的,富集mRNA(poly A+)RNA。
  • cDNA生产:细胞裂解后,在进行WTA前将gDNA去除,这是由于转录水平的精确测量依赖于消除gDNA污染所造成的假阳性结果。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物,所有的转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集)或只有多聚腺苷酸转录物(如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ 富集mRNA)将会被扩增。因此,该反应将包含一个随机引物和寡核苷酸dT引物的混合物或只有寡核苷酸dT引物,这就减少了rRNA的扩增,并确保cDNA的3'末端反转录(转录物的大小大约是700–1000bp)。
  • 连接反应:合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。由于该连接反应的性质,cDNA片段并未按照它们原本存在于细胞中的顺序组装。然而,这并不影响核酸序列的检测,如剪接区域,在下游应用中的进行NGS或qPCR。
  • 全转录本扩增:连接的cDNA随后被扩增,利用MDA技术与新颖REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase,等温反应2小时。
根据研究需要,我们针对从单细胞扩增cDNA或纯化RNA提供了不同的实验方案:
  • “从单细胞扩增mRNA(poly A+)3'端区域”实验方案只扩增带有poly A +尾巴的mRNA(和其他的RNA),适合于广泛的应用,包括NGS(RNA-Seq)、real-time PCR和微阵列分析。
  • “从单细胞扩增总RNA”实验方案可扩增完整的转录本,包括带有和不带有poly A +尾的RNA,lnc RNA和linc RNA。需要注意的是,rRNA也将扩增并且扩增程度很高。如果用序列特异性探针(例如用qPCR或阵列协同工作),扩增的rRNA并不会影响下游应用的结果。如果将扩增的RNA用于RNA-Seq,请注意超过90%的片段来自于rRNA,因此进行全转录本测序时必须获得充足的读段。
  • “纯化RNA的扩增”实验方案针对从总RNA或富集RNA模板进行全转录本扩增的情况而优化,非常适合于大规模应用,包括NGS、real-time PCR和微阵列分析。
Applications
REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从非常小量的样本均一地扩增全部的转录物,以非常有限或甚至可忽略地偏差扩增,准确呈递单细胞的转录模式。根据实验方法,扩增的cDNA非常适用于二代测序(RNA-Seq)、基因表达芯片或qPCR应用。
REPLI-g WTA Single Cell Kit可用于全转录本扩增的分析:
  • 带poly A+尾巴的mRNA
  • 总RNA
  • RNA转录组的所有区域
  • mRNA的3'末端
  • Lnc和Linc RNA
其不适合用于与小量核酸等一起使用:
  • tRNA和miRNA
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