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PAXgene Blood RNA Kit

从稳定于PAXgene Blood RNA Tubes的全血中分离和纯化胞间RNA

  • 符合欧洲体外诊断98/79/EC指令
  • 与采样、稳定及纯化形成整合的系统
  • 在18–25°C条件下可稳定多至3天
  • 在–20°C或–70°C条件下至少稳定60个月
  • 分析前标准化的样本处理过程

PAXgene Blood RNA系统包括用于血液采集、稳定和运输的PAXgene Blood RNA Tubes(由BD提供,货号762165),以及基于硅胶膜技术、离心柱法分离纯化的PAXgene Blood RNA Kit。纯化可使用离心机进行手工操作,也可在QIAcube全自动核酸纯化仪上自动运行。该产品表现卓越,确保高度可靠的RNA纯化。

Cat No./ID: 762174
PAXgene Blood RNA Kit (50)
50 PAXgene Spin Columns, 50 PAXgene Shredder Spin Columns, Processing Tubes, RNase-Free DNase I, RNase-Free Reagents and Buffers. To be used in conjunction with PAXgene Blood RNA Tubes

PAXgene Blood RNA Kit适用于体外诊断。


0
RNA纯化具有可重复性。
来自14位供体的血液样本一式四份,由3个技术员(A、B和C)手动处理。使用3套设备,每个技术员准备的所有样品使用同一套设备处理。[A]来自同一供体和不同技术员处理的重复样本获得的RNA量的平均值和标准偏差如图所示。[B]来自14个供体的样本,每个被分为12份,由3个不同的技术员处理。来自同一供体和所有技术员处理的每个样本获得的RNA量的平均值和标准偏差如图所示。所有RNA样本的A260/A280比例在1.8到2.2之间。
1
RNA产量具有可重复性。
在PAXgene Blood RNA Tubes中收集了30个不同供体的血液样本(每位供体有12管,一共360管)。抽取来自三个供体的管子,将管内含物分成36份样本。每3个供体有26份样本,由3位操作者手动处理这些样本。每位操作者使用来自不同批次的3个PAXgene Blood RNA Kit进行抽提,处理10组(每组3个供体)的每个供体4份的样本。[A] 每个操作者使用不同批次试剂盒的RNA产量和标准偏差。3位操作者(A、B、C)使用不同批次的试剂盒(1、2、3)处理10组(每组3个供体)的每个供体4份样本。图中显示了不同操作者和不同批次试剂盒处理同一组供体样本的平均产量和标准偏差。[B] 根据平均产量和产量的标准片擦计算的所有操作者和不同批次的供体组(A, B, C; 1, 2, 3)的RNA产量CV值。
2
手动PAXgene Blood RNA实验流程。
使用PAXgene Blood RNA处理,首先离心收集核酸于PAXgene Blood RNA Tube中。洗涤并重悬收集物,随后手动纯化RNA。
3
自动PAXgene Blood RNA实验流程。
使用PAXgene Blood RNA处理,首先离心收集核酸于PAXgene Blood RNA Tube中。洗涤并重悬收集物,随后自动化纯化RNA。
4
RNA在18–25°C的稳定性:FOS。
血液来自10位供体,一式两份,在18–25°C存放图示天数,随后纯化总RNA。[A]收集血液并存放在PAXgene Blood RNA Tubes中,使用PAXgene Blood RNA Kit纯化总RNA。[B]收集血液并存放在标准的血液收集管中(含有EDTA作为抗凝剂),使用标准的有机提取方法配合基于硅胶膜的RNA纯化方法纯化总RNA。FOS的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,并给出所有样本的平均值和标准偏差。虚线表示该分析的±3x总精密度(2.34 CT)。
5
RNA在18–25°C的稳定性:IL1B。
血液来自10位供体,一式两份,在18–25°C存放图示天数,随后纯化总RNA。[A]收集血液并存放在PAXgene Blood RNA Tubes中,使用PAXgene Blood RNA Kit纯化总RNA。[B]收集血液并存放在标准的血液收集管中(含有EDTA作为抗凝剂),使用标准的有机提取方法配合基于硅胶膜的RNA纯化方法纯化总RNA。IL1B的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,并给出所有样本的平均值和标准偏差。虚线表示该分析的±3x总精密度(1.93 CT)。
6
RNA在2–8°C的稳定性:IL1B。
血液来自10位供体,一式两份,在2–8°C存放图示天数,随后纯化总RNA。[A]收集血液并存放在PAXgene Blood RNA Tubes中,使用PAXgene Blood RNA Kit纯化总RNA。[B]收集血液并存放在标准的血液收集管中(含有EDTA作为抗凝剂),使用标准的有机提取方法配合基于硅胶膜的RNA纯化方法纯化总RNA。IL1B的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,并给出所有样本的平均值和标准偏差。虚线表示该分析的±3x总精密度(1.93 CT)。
7
RNA在2–8°C的稳定性:FOS。
血液来自10位供体,一式两份,在2–8°C存放图示天数,随后纯化总RNA。[A]收集血液并存放在PAXgene Blood RNA Tubes中,使用PAXgene Blood RNA Kit纯化总RNA。[B]收集血液并存放在标准的血液收集管中(含有EDTA作为抗凝剂),使用标准的有机提取方法配合基于硅胶膜的RNA纯化方法纯化总RNA。FOS的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,并给出所有样本的平均值和标准偏差。虚线表示该分析的±3x总精密度(2.34 CT)。
8
不同使用者的实验结果具有可重复性。
血液样本来自30位供体,收集到PAXgene Blood RNA Tubes中(每位供体12管,一共360管)。抽取来自3位供体的血液样品并从新分装为36个样本。这36个样本由3位技术员手动处理。每位技术员使用3种不同批次的PAXgene Blood RNA Kit,提取并处理10管一式四份的样本。[A] FOS和[B] IL1B的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,以第一个技术员的数据(10管样本x3批试剂盒x4副孔=每个基因120个数据)为对照,并给出所有样本的平均值(红线)和标准偏差(黑色柱)。虚线表示该分析的±3x总精密度(FOS,2.34 CT;IL1B,1.93 CT)。
9
不同批次试剂盒的实验结果具有可重复性。
血液样本来自30位供体,收集到PAXgene Blood RNA Tubes中(每位供体12管,一共360管)。抽取来自3位供体的血液样品并分装为36个样本。这36个样本由3位技术员手动处理。每位技术员使用3个来自不同批次的PAXgene Blood RNA Kit,提取并处理10管一式四份的样本。[A] FOS和[B] IL1B的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。用所有样本的数据做图,以第一批试剂盒的数据(10管样本x3位技术员x4副孔=每个基因120个数据)为对照,并给出所有样本的平均值(红线)和标准偏差(黑色柱)。虚线表示该分析的±3x总精密度(FOS,2.34 CT;IL1B,1.93 CT)。
10
自动和手动实验方案具有可重复性。
3位技术员(A、B和C)使用3个不同批次的PAXgene Blood RNA Kit按照图"RNA yield and purity — automated processing"的自动化试验方案纯化RNA。同时也手动处理相应的样本。[A] FOS和[B] IL1B的相对转录水平通过real-time,双重RT-PCR确定,18S rRNA作为内参。ΔΔCT方法确定这2种实验方案(自动化和手动处理方案)是否会有转录水平的差异。用所有样本对的ΔΔCT值做图(4副孔x 8位供体x 3批试剂盒x 3位技术员=每个基因288对),并给出所有样本的平均值(较大的点)和标准偏差(黑色柱)。虚线表示该分析的±3x总精密度(FOS,2.34 CT;IL1B,1.93 CT)。
11
RNA产量和纯度 — 自动处理。
血液样本来自48位供体,收集到PAXgene Blood RNA Tubes中(每位供体6管,一共288管)。抽取来自6位供体的血液样品并分装为36个样本。这36个样本由3位技术员(A、B和C)处理。每位技术员使用3个来自不同批次的PAXgene Blood RNA Kit,自动提取并处理8管一式四份的样本。图中显示了所有技术员和不同批次试剂盒处理样本的RNA产量、A260/A280值和基因组DNA的量(w/w)。
Performance

PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA,在18–25°C条件下可稳定长达3天(参见"RNA stability at 18–25°C: FOS"和"RNA stability at 18–25°C: IL1B"),或在2–8°C条件下稳定长达5天(参见"RNA stability at 2–8°C: FOS"和"RNA stability at 2–8°C: IL1B")。当前的数据显示,细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。

使用PAXgene Blood RNA System纯化的总RNA纯度高,A260/A280 值在1.8和2.2之间,且基因组DNA含量不超过1.0% (w/w)。当使用30%的洗脱液时,至少95%的样品在RT-PCR中没有出现反应抑制的情况。

样品制备的平均时间为90分钟(根据12个样品的制备时间),手工操作只需40分钟。在处理95%以上样品时,2.5 ml健康人类全血的RNA产量不低于3 µg。由于产量高度依赖于供体,单次产量可能会有变动。对于单个供体,PAXgene Blood RNA System 确保产量可重复性高(参见Reproducible and repeatable RNA purification"和"Repeatability and reproducibility of RNA yield")以及RT-PCR的可重复性高(参见"Reproducibility between users"、"Reproducibility between kit lots", 和表格),高度适合于临床诊断检测。

对于超过95%的样本,从2.5 ml健康人类全血中获得的RNA产量不少于3 μg。图片"RNA yield and purity — automated processing"显示的是3名实验员使用3批试剂盒自动化处理288个样本的RNA产量。由于使用的是混合血液样本而非单个的PAXgene Blood RNA Tubes,实验结果不能反映单一个体血液样本的RNA预期产量。由于产量高度依赖于供体,单个产量会有差别。

当使用多至30%的洗脱液时,至少95%的样品不会出现RT-PCR抑制。通过对RNA阴性样品(水)中beta-球蛋白和FOS转录子序列与RNA阳性样本(人类全血)进行定量RT-PCR分析,未发现使用自动化流程处理样品中有交叉污染。

使用PAXgene Blood RNA System的自动流程制备的RNA纯度高,没有RT-PCR抑制(见上文),A260/A280值在1.8 和2.2之间。经real-time PCR分析beta-肌动蛋白的序列发现,超过95%的样品的基因组DNA含量不高于1% (w/w) 。图片"RNA yield and purity — automated processing"显示了3个实验员使用3批试剂盒处理288个样品的A260/A280值和相对基因组DNA含量。

如图"Reproducibility between automated and manual protocols"所示,使用PAXgene Blood RNA System自动纯化RNA的流程提供高度可重复的RT-PCR结果,适用于临床诊断检测。

RT-PCR数据总结
检测系统  FOS/18S rRNA assay  IL1B/18S rRNA assay
数据对比  平均值  ± SD  平均值 ± SD
 (ΔΔCT)  (ΔΔCT)  (ΔΔCT) (ΔΔCT)
 同一使用者使用不同批试剂盒的可重复性
 所有使用者,第一批–第一批  0.00  0.00  0.00  0.00
 所有使用者,第一批–第二批  –0.03  0.48  –0.07  0.66
 所有使用者,第一批–第三批  –0.21  0.52  0.11  0.71
 不同使用者使用同一批试剂盒的可重复性 
 所有批次,使用者A–使用者A  0.00  0.00  0.00  0.00
 所有批次,使用者A–使用者B  –0.46  0.44  –0.06  0.69
 所有批次,使用者A–使用者C  –0.31  0.60  –0.15  0.71
使用者:进行研究的实验员。
批次:本次研究中使用的试剂盒的批次。
SD:标准差。
计算平均值ΔΔCT (N = 120) 和标准差的数据来源于图"Reproducibility between users"和"Reproducibility between kit lots"。
Principle

PAXgene Blood RNA Kit用于从在PAXgene Blood RNA Tube中采集的2.5 ml人类全血中纯化总RNA,操作简单,可手工操作,也可自动化运行(参见"Manual PAXgene Blood RNA procedure"和"Automated PAXgene Blood RNA procedure")。

PAXgene Blood RNA Tubes 含有专利申请中的特定试剂,基于RNA固定的专利技术(US Patents 6,602,718 和6,617,170)。这些试剂成分可保护RNA分子,避免其被RNA酶降解,并将基因表达体内变化的改变降至最小。PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA,在18–25°C条件下可稳定长达3天(参见"RNA stability at 18–25°C: FOS"和"RNA stability at 18–25°C: IL1B"),或在2–8°C条件下稳定长达5天(参见"RNA stability at 2–8°C: FOS"和"RNA stability at 2–8°C: IL1B")。当前的数据显示,细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。

Procedure

PAXgene Blood RNA纯化操作流程简单,可手动或自动进行(参见"Manual PAXgene Blood RNA procedure"和"Automated PAXgene Blood RNA procedure")。

PAXgene Blood RNA纯化手动流程

将重悬的沉淀和蛋白酶K一起溶解在经优化的缓冲液中孵育,进行蛋白质酵解。然后应用PAXgene Shredder离心柱再次离心,匀浆细胞裂解液,并去除剩余的细胞残骸。将流过部分的上清液转移到干净的微型离心管中,加入乙醇调节结合条件,将裂解液装入一个PAXgene RNA离心柱中。快速离心后,RNA会选择性地结合到PAXgene硅胶膜上,杂质则流过。剩余的杂质通过几次高效洗涤去除。在第一次和第二次洗涤步骤之间,使用DNA酶处理膜,以去除微量残余的DNA。洗涤之后,使用洗脱缓冲液洗脱RNA并进行热变性。

PAXgene Blood RNA纯化自动流程

使用QIAcube全自动核酸纯化仪制备样品的流程与手动法相同,您可继续使用PAXgene Blood RNA Kit纯化高品质RNA。

自动化的RNA纯化流程由两个部分组成,"PAXgene Blood RNA Part A"和"PAXgene Blood RNA Part B",在两个部分之间需要短暂的手工操作。

将经离心、洗涤、重悬的核酸沉淀从PAXgene Blood RNA Tube转移到离心管中,将离心放到QIAcube全自动核酸纯化仪工作台的恒温震荡器中。实验员选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part A"。QIAcube全自动核酸纯化仪会自动运行,直到将RNA洗脱至洗脱缓冲液中。实验员将含有已纯化RNA的离心管转移到QIAcube全自动核酸纯化仪的恒温震荡器中,选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part B",QIAcube全自动核酸纯化仪会执行热变性。

样本平均制备时间是125分钟(基于制备12个样本的时间),手工操作时间只需约20分钟。

Applications

该试剂盒与PAXgene Blood RNA Tubes共同使用,可从全血中分离纯化细胞内RNA进行RT‑PCR。

Features
Specifications
应用 RT-PCR
符合CE/FDA/IVD CE
洗脱体积 40 µl
规格 Spin column
主要样本类型 Whole blood
处理 Manual (centrifugation)
样本量 2.5 ml
技术 Silica technology
Time per run 90 min/12 samples
产量 >3 µg

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应用说明 (2)
In situ stability of RNA in blood specimens stored for 8 years (96 months) at –20°C and –70°C in PAXgene Blood RNA Tubes

 


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Typical total RNA yields from PAXgene Blood RNA Tubes processed with the PAXgene Blood RNA Kit
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