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QIAseq Targeted RNA Panels

用于基因表达图谱分析的数字RNAseq
  • 能够同时检验数百个样本中的数百个基因
  • 仅需25 ng的总RNA
  • 在1天时间内完成从样本制备到文库构建的流程
  • 分子条形码保证了表达图谱分析的准确性
QIAseq Targeted RNA Extended Panel为通过RNAseq进行定量基因表达谱分析的“从样本制备到数据解读”解决方案。这些panel结合了分子条形码技术和两步法PCR的文库制备,为数字RNA测序结果提供无偏差、准确地定量检测。QIAseq Targeted Panels已经过湿法验证,实验结果具有高度准确度。
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QIAseq Targeted RNA Panels适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
数字测序(分子条形码)原理
QIAseq Targeted RNA Panels采用数字测序法。通过这种方法,可将整合有12个碱基对随机分子条形码的基因特异性引物(GSP1)掺入PCR的第一次延伸反应(在这之后mRNA将逆转录成cDNA)。因此,每次延伸反应都将生成一对分子条形码和目标序列的结合体。在测序完成之时,通过测定结合的分子条形码数量确定每个目标mRNA的相对含量,从而消除了PCR反应中模板复制和扩增所引入的误差,进而获得更加准确、无偏差的基因表达分析结果。
1
突破基因表达分析技术瓶颈的解决方案
QIAseq Targeted RNA Panel是用于RNAseq定量基因表达分析的“从样本制备到数据解读”解决方案。这些panel结合了分子条形码技术和两步法PCR的文库制备法,突破了PCR反应中模板复制和扩增将引入误差的技术瓶颈,能够获得无偏差、准确、可重复性好的基因表达结果。
2
无偏差、准确的基因定量(A)
采用不同起始量(20 ng、5 ng或1.25 ng)的通用对照RNA进行靶向RNAseq反应,确定三种基因(BNIP1、CTNND2和DAPK1)的表达水平。QIAseq的数字RNA测序法(A:分子条形码数量)可获得不同起始量RNA所对应的三种基因(BNIP1、CTNND2和DAPK1)的准确定量检测结果,而传统的靶向RNAseq(B:序列数量)则反映出了PCR模板复制的限制,因而其定量结果是不准确的。
3
无偏差、准确的基因定量检测结果(B)
采用不同起始量(20 ng、5 ng或1.25 ng)的通用对照RNA进行靶向RNAseq反应,确定三种基因(BNIP1、CTNND2和DAPK1)的表达水平。QIAseq的数字RNA测序法(A:分子条形码数量)可获得不同起始量RNA所对应的三种基因(BNIP1、CTNND2和DAPK1)的准确定量检测结果,而传统的靶向RNAseq(B:序列数量)则反映出了PCR模板复制的限制,因而其定量结果是不准确的。
4
专有的引物设计法能够获得具有基因特异性的扩增子(特异性高于97%)
利用QIAseq Targeted RNA Panel并使用含量分别为1.25 ng、5 ng和20 ng的通用对照RNA,可构建12重至1000重的测序文库。在Illumina MiSeq上进行测序,每个样本可得到1百万个reads。特异性指的是与预定目标片段对比,修剪并比对过后的reads所占的百分比。
5
卓越的一致性(高于97%的实验结果位于分子标记数中位数的20%内)
利用917-plex gene panel可从10 ng的NA12878对照DNA构建基因文库。所有实验均设计为覆盖单一外显子内,因此在基因组DNA上为单拷贝。这样可在文库构建阶段(例如每个独有的标签相当于一个捕获的单拷贝)可对扩增子性能的一致性进行估计。根据原始实验结果,有97.5%的实验结果处于分子标签数量中位数/平均数的20%。在RNAseq计数中,分子条形码可全面消除非均一性的结果。
6
简单的操作流程
通过25 ng的完整RNA片段合成cDNA。在进行扩增反应之前,每个cDNA分子均带上独有的分子条形码。这种带上独有标签的cDNA分子在两步 PCR反应中得到扩增,进而完成文库构建。从RNA样本到完成待测序的文库构建,整个过程仅需6个小时。
7
对每个细胞低至0.2拷贝的RNA含量亦可获得阳性检测结果
在86至705500个拷贝数范围内,将ERCC标准品应用于通用对照RNA样本并使用384-plex的QIASeq Targeted RNA Panel将其富集,实验重复三次。(A)灵敏性测定:在标准条件下(RNA起始量20 ng,50万个Miseq reads)可检测到≥100个拷贝数的ERCC转录物,相当于每个细胞0.2个拷贝数。(B)精确性测定:在高于10个分子条形码/基因条件下,所有目标片段的CV值均低于5%,表明实验具有良好的可重复性。这与样本中含有100个拷贝数的RNA结果相符。
8
与qPCR检测结果高度一致
同时采用QIAseq Targeted RNA Panel和qPCR技术对Human Brain Reference RNA (HBRR)和Universal Human Reference RNA (UHRR)的384个基因表达水平进行测定。由qPCR测得的表达水平结果用管家基因(ACTB、B2M、GAPDH和RPLP0)表达量的平均值校正,每个基因在两个样本间的倍数变化也通过计算(HBRR/UHRR)获得。对于采用QIAseq的测定结果,每个基因标记的独有分子条形码数量通过计数获得,并用上述四种管家基因标记的分子条形码数平均值对每个基因的表达水平进行均一化,并计算每个基因的倍数变化。QIAseq Targeted RNA Panel和qPCR的实验结果表明,二者在基因表达水平上的倍数变化极为相似,证明了QIAseq检测结果的准确性。
Performance
  • 准确性:创新的数字测序技术(分子条形码计数法)消除了PCR复制和扩增引入的偏差,可获得准确的结果(参见图无偏差、准确的基因定量检测结果
  • 特异性:独创性地将专有的引物设计算法和每个引物延伸实验的严格检测相结合,保证了结果的高度特异性和准确性(参见图专有的引物设计– 97%的特异性)。
  • 一致性:QIAseq Targeted RNA Panel工作流程已经过优化,可获得高度一致的测序结果,保证仪器的测序能力得到有效利用。实际上,数字测序(分子条形码)已完全消除了RNAseq计数中产生的数据波动(请参见图卓越的一致性 – 97%的实验结果均处于分子标记数中位数的20%内)。
  • 可重复性:QIASeq Targeted RNA Panel系统重复性强,在重复样本、不同批次产品和不同仪器的检测结果间存在很强的相关性,平均相关系数高于0.99,保证了检测的可靠性。
  • 灵敏性:数字RNA测序系统已经过优化,可获得极为可靠的定量检测结果,可定量25 ng总RNA之中低至100个拷贝的RNA靶标(参见图每个细胞低至0.2个拷贝数RNA的阳性测定结果)。
  • 灵活性:QIAseq panel将NGS的强大功能和qPCR的准确性合为一体。在获得高性价比数据结果的同时,可通过单次NGS多重检测多个样本。
Principle
  • 传统的RNA测序方法会受到PCR反应中模板复制和扩增的影响而引入误差,导致基因表达分析不够准确。QIAseq Targeted RNA Panel在进行PCR扩增反应之前引入分子条形码,消除了上述问题从而能够对基因进行准确的数字化定量(参见图客观、准确地基因定量)。
  • QIAseq Targeted RNA Panel的优势在于包含内参反应体系,能够对RNA样本中任何由gDNA造成的污染进行控制,从而获得可重复性高的实验结果。管家基因(HKG)实验用于归一化数据,从而可对比各样本及运行批次间的结果。
Procedure
  • QIAseq Targeted RNA Panel在使用时,首先将所有的RNA全部逆转录成cDNA(参见图简单的操作流程)。实验所需的起始总RNA量可低至25 ng,而无需进行各种类型的富集步骤。在分子条形码标记步骤,需要使用多重检测引物panel(靶向12-1000个基因)中带有分子标签且具有基因特异性的引物(GSP1),和20ng的cDNA等效物(由20ng RNA逆转录得到的cDNA)。在条形码标记步骤之后,将带有特异标记的cDNA用磁珠纯化以去除残留的引物。随后,采用第二个引物池构建PCR。该引物池中含有带基因特异性接头的引物(GSP2)和可去除GSP1引物通用标签的RS2引物。该反应可确保预定目标基因得到充分富集从而出现在最终的文库中。此设计可以最大限度缩短反应循环次数,最大限度减少扩增过程中PCR引入的误差(所有误差均可用分子标签作简单修正)。第二次反应之后同样用磁珠对cDNA进行纯化并采用RS2和FS2引物进行universal PCR,反应中对每个样本同样加入样本索引条形码,以用于测序过程中的样本区分。纯化最终产物后,即构建出可直接用于定量和测序的文库。
  • QIAseq Targeted RNA Panel的功能包括数据分析和解读。目前我们已为其开发出全面、易用的数据分析模块。即使您并非生物信息学专家,也可自如地使用这些模块。首先从测序仪上获得原始序列,再使用QIAGEN的GeneGlobe网站首页上的QIAseq靶向RNA数据分析工具,即可获得基因数量、倍数变化的信息以及通路分析结果。
Applications
  • 基因表达谱分析
  • 生物标志物研究
  • 全转录组测序数据验证
  • 微阵列数据验证
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