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PhosphoProtein Purification Kit

亲和层析方法纯化磷酸化蛋白

  • 将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白完全分离
  • 试剂盒提供分离柱、缓冲液、试剂和超滤柱等
  • 无需放射性标记,就可进行细胞信号转导研究

PhosphoProtein Purification Kit基于亲和层析法,将细胞裂解液中的磷酸化和非磷酸化蛋白完全分离,由此便于研究整个细胞和特定蛋白的磷酸化状态。此外,可方便地确定磷酸化和非磷酸化蛋白的比率,这对于研究低丰度蛋白是非常有用的。PhosphoProtein Purification Kit包括离心柱、试剂、缓冲液和用于蛋白高效浓缩和脱盐的Nanosep Ultrafiltration Columns。

Cat No./ID: 37101
PhosphoProtein Purification Kit (6)
6 PhosphoProtein Purification Columns, 6 Nanosep Ultrafiltration Columns, Reagents, Buffers

PhosphoProtein Purification Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
高度特异性分离磷酸化蛋白。
在体内使用32P对未刺激Jurkat细胞进行放射性标记。使用PhosphoProtein Purification Kit处理细胞裂解液,测量每种组分的放射性。(数据由Gudrun Rehg和Sascha Dammeier, Byk Gulden, Konstanz, 德国提供)。
1
磷酸化蛋白纯化流程。
2
完全分离未磷酸化和磷酸化的蛋白。
完全分离未磷酸化蛋白和磷酸化蛋白。对[A]未磷酸化的HSP-60蛋白、[B]磷酸化p44和p42丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)蛋白质进行蛋白特异性免疫监测。F:流出液;E:洗脱液。用于检测MAPK的抗体可识别p44(上方条带)和p42(下方条带)MAPK氨基酸序列中Thr202和Tyr204的含有磷酸化残基的表位。洗脱液中不含未磷酸化HSP-60蛋白,流出液中不含磷酸化MAPK蛋白,这说明使用PhosphoProtein Purification Kit可完全分离未磷酸化和磷酸化蛋白。
3
高效富集用于2D-PAGE磷酸化蛋白质组分析。
在37°C下,使用磷酸酶抑制剂Calyculin(100 nM)和钒酸(1 mM)处理HeLa细胞20分钟。 [A]收获和裂解细胞后,取一份裂解液,通过2D-PAGE进行蛋白分离,使用非特异性总蛋白染料(蓝色)和磷酸化蛋白特异性染料(橙色,图片有重叠)观察蛋白。[B]再取一份裂解液,使用PhosphoProtein Purification Kit处理,(含有磷酸化蛋白)的洗脱液按照之前方法进行处理。重叠的蛋白斑点染为黑色。图片分析表明,87%的洗脱的蛋白为磷酸化蛋白。
4
对流出液和洗脱液进行SDS-PAGE分析。
使用PhosphoProtein Purification Kit处理细胞裂解液的流出液(左边泳道)和洗脱液(右边泳道)。在凝胶上样前,两种溶液都进行了10%浓缩。通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质。
Performance
PhosphoProtein Purification Kit可高特异性分离磷酸化蛋白,并且完全分离磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白(参见''Highly specific separation of phosphorylated proteins"和"SDS-PAGE analysis of flow-through and eluate fractions")。PhosphoProtein Purification Kit也适用于蛋白质组的分析(参见"Efficient enrichment for 2D-PAGE phosphoproteome analysis")。
Principle

PhosphoProtein Purification Kit基于亲和层析法,将细胞裂解液中的磷酸化和非磷酸化蛋白完全分离,由此便于研究整个细胞和特定蛋白的磷酸化状态。使用高特异性小鼠单克隆抗体PhosphoThreonine和PhosphoSerine Western印迹之后鉴定磷酸化蛋白,这两种抗体可辨别由磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基组成的表位,而与周围的氨基酸无关(参见"Complete separation of unphosphorylated and phosphorylated proteins")。

Procedure

每个PhosphoProtein Purification Column可从107个真核细胞中纯化磷酸化蛋白(相当于2.5 mg总蛋白)。细胞溶解于裂解缓冲液中,其中去污剂和核酸酶用于分解蛋白混合物,蛋白酶抑制剂用于防止蛋白降解。将澄清的裂解液上样到 PhosphoProtein Purification Column,裂解液中的磷酸化蛋白结合到柱子上,非磷酸化蛋白则流过柱子。洗涤之后,从柱子上洗脱磷酸化蛋白(参见"Phosphoprotein purification procedure")。通常,总蛋白的10%为磷酸化蛋白(取决于细胞类型和状态)。两种蛋白都保持生物活性,在有需要的情况下可进一步纯化。PhosphoProtein Purification Kit中提供Nanosep Ultrafiltration Columns,确保蛋白的高效浓缩和脱盐。表格中为应用PhosphoProtein Purification Kit进行分离时,每种蛋白的常规产量。

PhosphoProtein Purification Kit分离获得的磷酸化蛋白的产量
细胞类型 细胞数量 细胞裂解液中的总蛋白(µg) 上样到离心柱的蛋白(µg) 洗脱液中的蛋白 (µg) 磷酸化蛋白含量百分比
CHO 1.5 x 107 3400 2500 300 12%
NIH 3T3 n.d. 2750 2500 165 7%
293 1.5 x 107 3650 2500 200 8%
Cos-7 4.5 x 106 1700 1700 120 7%
Huh-7 8.5 x 106 2650 2500 235 9%
HT 29 n.d. n.d. 2500 200 8%
LT 23 n.d. n.d. 2500 275 11%
HeLa S3 1.8 x 107 5950 2500 280 11%
HeLa Acc57 6.6 x 106 2500 2500 235 9%
Applications

PhosphoProtein Purification Kit可完全分离磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白,分离后的磷酸化蛋白适用于以下研究:

蛋白组学 
细胞信号转导和凋亡研究 
蛋白激酶和肿瘤学研究 
免疫失调研究
Features
Specifications
应用 SDS-PAGE, mass spectrometry
结合能力/产量 500 µg
分离组分 Two fractions
翻译后修饰蛋白 Phosphorylation
样本大小 ~1 x 10e7 cells
物种 Eukaryotes
起始材料 Cells

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