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TAGZyme Qcyclase/pGAPase Enzymes

去除使用TAGZyme pQE载体表达的蛋白N端的His标签,这些蛋白含有非天然的终止位点

  • 高特异性N端外切酶活性,避免内部切割
  • 在37°C,只需30分钟即可去除95%以上的标签
  • 高纯度的最终产物
  • 采用Ni-NTA方法,完全去除污染物

重组的TAGZyme Qcyclase和pGAPase Enzymes可与TAGZyme DAPase Enzyme相配合,去除由TAGZyme pQE-1载体表达的含有谷氨酰胺残基的蛋白的His标签。谷氨酰胺残基在过量Qcyclase酶作用下变成焦谷氨酸,形成DAPase终止位点。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基能被pGAPase酶去除。TAGZyme Qcyclase和pGAPase酶在C端都含有未切割的His标签,能通过IMAC从反应液中去除,从而回收得到纯化的、无标签的目的蛋白。

Cat No./ID: 34342
TAGZyme Qcyclase/pGAPase Enzymes (150 U)
For processing of approximately 50 mg tagged protein: 150 units Qcyclase Enzyme, 50 units pGAPase Enzyme

TAGZyme Qcyclase/pGAPase Enzymes适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


Performance
TAGZyme DAPase Enzyme可有效去除His标签N端到“终止位点”间的肽,蛋白可由TAGZyme pQE载体表达(参见"Efficient His-tag removal")。当谷氨酰胺残基作为终止位点时,可被DAPase-Qcyclase和pGAPase的共同作用去除。通过消减IMAC可从反应液中获得真正的目的蛋白。由于TAGZyme DAPase Enzyme、Qcyclase和pGAPase酶自身C-端带有未切割的His标签,它们和未处理的His-tagged重组蛋白能被有效去除。
Principle

His-tagged重组蛋白是研究蛋白结构和功能的重要工具。His标签很小并具有较低的免疫原性,使它通常不需要被去除。但是,不含有载体源氨基酸的蛋白产物更适用于一些应用,例如通过X射线或NMR进行结构研究,或生产具有治疗效果的药物。

TAGZyme体系从蛋白上去除N端的His标签,具有很高的特异性和效率。DAPase酶用于切割纯化得到His-tagged蛋白N端的肽。当酶切割到“终止位点”时,消化就会停止,终止位点是一个不能作为底物的氨基酸基序(见表“DAPase终止位点”)。如果重组蛋白自身不含有DAPase终止位点,可通过在载体上插入谷氨酰胺密码子来引入。在表达的蛋白中,谷氨酰胺变成焦谷氨酸,成为DAPase酶的终止位点(参见"His-tag removal")。

DAPase终止位点
氨基酸 DAPase终止位点 (↓) 序列*
 赖氨酸(Lys, K)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa Lys-Xaa...
 精氨酸(Arg, R)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Arg-Xaa...
 脯氨酸(Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Xaa-Pro-Xaa...
 脯氨酸(Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Pro-Xaa-Xaa...
 谷氨酰胺(Gln, Q)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Gln-Xaa...
 异亮氨酸(Ile, I)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Ile-Xaa-Xaa...
*天然的DAPase终止位点(↓)是二肽内指定位点紧接的氨基酸(被切掉的二肽标有下划线)。
†在过量Qcyclase。Enzyme存在条件下,谷氨酰胺残基变为焦谷氨酸。
Procedure

使用TAGZyme pQE-2载体表达自身含有终止位点的重组蛋白,不管DNA片段插入位点如何,都可完全、有效地去除N端His标签。使用DAPase酶孵育后,反应混合物加入到Ni-NTA基质中进行消减固定金属亲和层析色谱(IMAC)(参见"Purification of detagged proteins")。His标签片段和TAGZyme DAPase Enzyme(C-端带有未切割的His标签)与基质结合,在穿透液中可回收到纯化的、无标签的目的蛋白。

当蛋白自身不含有DAPase终止位点时,可通过表达载体插入谷氨酰胺密码子,从而向蛋白序列中引入终止位点。TAGZyme pQE-1载体可在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酰胺残基,可配合TAGZyme体系发挥作用。谷氨酰胺残基位于His标签后的奇数位位点,正好在原始蛋白第一个氨基酸之前。使用DAPase酶和过量的Qcyclase酶可去除His标签。通过DAPase酶去除His标签肽后,谷氨酰胺残基暴露在N端。反应液中过量的Qcyclase酶能将N端的谷氨酰胺残基催化形成焦谷氨酸。N端含有焦谷氨酸的二肽不能作为DAPase酶的底物,进一步的切割就被终止了。反应液进行一轮消减IMAC,His-tagged TAGZyme DAPase和Qcyclase酶就能被去除。在穿透液中可收集到目的蛋白。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基可被His-tagged pGAPase酶去除,pGAPase酶能被第二轮消减IMAC去除,在穿透液中即可获得纯化的、无标签的目的蛋白。

Applications

TAGZyme体系提供特异性切割、重组试剂的使用以及完全去除污染物,是获得不含His标签蛋白的理想选择,适合的应用包括:

  • 通过NMR或X射线结晶确定蛋白结构
  • 生产具有治疗功能的蛋白
Features
Specifications
应用 Production of therapeutic proteins, protein structure determination using NMR or X-ray crystallography
去除标签的效率 >95%
去除片段和未吸附蛋白 Yes
特性 Complete removal of contaminants
标签去除 Exoproteolytic
时间 30 minutes

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试剂盒操作手册 (1)
For Exoproteolytic cleavage of N-terminal His tags
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参考文献
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