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TAGZyme DAPase Enzyme

去除TAGZyme pQE载体表达蛋白N端的His标签

  • 高特异性外切酶活性避免内部切割
  • 37°C下只需30分钟即可高效去除95%以上的标签
  • 高纯度的终产物
  • 采用Ni-NTA方法,完全去除污染物

TAGZyme pQE载体表达的N端His标记蛋白的二肽,能被TAGZyme DAPase Enzyme高效持续地去除。TAGZyme DAPase Enzyme是一种C端带有His标签的重组外切酶,能通过金属螯合亲和层析(IMAC)从反应液中去除,从而在流出液中得到纯化的无标签的目的蛋白。

Cat No./ID: 34362
TAGZyme DAPase Enzyme (2.5 U)
For processing of approximately 50 mg tagged protein: 2.5 units DAPase Enzyme, 20 mM Cysteamine-HCl (1 ml)
Cat No./ID: 34366
TAGZyme DAPase Enzyme (50 U)
For processing of approximately 1 g tagged protein: 50 units DAPase Enzyme, 20 mM Cysteamine-HCl (25 ml)

TAGZyme DAPase Enzyme适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


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去标签的蛋白纯化。
剪切纯化策略示意图。[A] 包含天然DAPase终止点的蛋白的操作步骤。[B] 包含引入的谷氨酰胺DAPase终止点的蛋白的操作步骤。
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高效去除His标签。
使用TAGZyme系统,从6xHis-tagged的人肿瘤坏死因子α (hTNFα) 中去除标签。1:纯化的6xHis-tagged hTNFα。2:采用DAPase和Qcyclase酶在37°C下孵化10分钟后。3:采用DAPase和Qcyclase酶在37°C下孵化20分钟后。4:采用DAPase和Qcyclase酶在37°C下孵化30分钟后。5:去标签反应结束后,利用差减IMAC回收焦谷氨酰延伸的hTNFα,进行pGAPase酶切,成熟的hTNFα可经过第二次差减IMAC回收至流出液部分。6:取少量处理后的蛋白,加入过量的DAPase (0.125 U/mg hTNFα) 孵化2小时,以分析pGAPase催化的焦谷氨酸盐的去除效率。可以观察到His-tagged DAPase酶的两个亚基。对所有样本进行SDS-PAGE电泳,并采用Coomassie Blue染色凝胶。M:分子量标准。
2
去除His标签。
使用TAGZyme酶的整体切割策略示意图。[A] DAPase酶将N末端His标签从包含天然终止点的蛋白质上剪切下来,获得成熟的目的蛋白。[B] 将N末端His标签从蛋白质上剪切下来可激活谷氨酰胺终止点。利用DAPase酶剪切二肽后,N末端谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸盐,在pGAPase酶的作用下可将其去除。
Performance
对于TAGZyme pQE 载体表达的蛋白,TAGZyme DAPase Enzyme可高效依次去除其N端His 标签与“终止位点”间的二肽(参见 "Efficient His-tag removal")。通过逆向金属螯合亲和层析可从反应液中获得真正的目的蛋白。由于TAGZyme DAPase Enzyme的C 端带有不可切割的His 标签,它和未处理的His标记重组蛋白能被高效去除。
Principle

His标签重组蛋白是研究蛋白结构和功能的重要工具。His标签片段较小并具有较低的免疫原性,通常不需要被去除。但是,不确定来源氨基酸的蛋白产物更适用于一些应用,例如通过X射线或NMR进行结构研究,或治疗性蛋白的合成。

TAGZyme体系可特异并高效去除重组蛋白N端的His标签。DAPase酶用于依次切割纯化的His标签蛋白N端的二肽(参见"His-tag removal")。当酶切割到“终止位点”时,消化就会停止,终止位点是一个不能作为底物的氨基酸基序(见表“DAPase终止位点”)。如果一个重组蛋白自身不含有DAPase终止位点,可通过在载体上插入谷氨酰胺密码子来引入。在被表达的蛋白中,谷氨酰胺变成焦谷氨酸,成为DAPase酶的终止位点。

DAPase终止位点
氨基酸 DAPase 终止位点 (↓) 序列*
 赖氨酸 (Lys, K)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa Lys-Xaa...
 精氨酸 (Arg, R)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Arg-Xaa...
 脯氨酸 (Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Xaa-Pro-Xaa...
 脯氨酸 (Pro, P)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Pro-Xaa-Xaa...
 谷氨酸 (Gln, Q)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Gln-Xaa...
 异亮氨酸 (Ile, I)  Xaa-Xaa...Xaa-Xaa ↓ Xaa-Ile-Xaa-Xaa...
* 天然的DAPase终止位点 (↓) 是二肽内指定位点紧接的氨基酸(被切掉的二肽标有下划线)。
在过量Qcyclase.酶存在时,谷氨酰胺残基变为焦谷氨酸。
Procedure

使用TAGZyme pQE-2载体表达的自身含有终止位点的重组蛋白,无论DNA插入位点如何,都可完全高效地去除其N端His标签。使用 DAPase孵育后,反应液加入到Ni-NTA基质中进行逆向金属螯合亲和层析(IMAC)(参见 "Purification of detagged proteins")。His标记片段和TAGZyme DAPase酶(C 端带有不被切割的His标签)与基质结合,从流出液中可回收到纯化的无带标签目的蛋白。

当蛋白自身不含有DAPase终止位点时,可通过表达载体插入谷氨算密码子,从而向蛋白序列中引入终止位点。TAGZyme pQE-1载体可在His标签序列和蛋白序列之间编码一个谷氨酸残基,从而配合TAGZyme体系发挥作用。谷氨酸残基位于His标签后的奇数位位点,恰位于原始蛋白第一个氨基酸之前。使用DAPase和过量的Qcyclase可去除His标签。通过DAPase去除His标签二肽后,谷氨酸残基暴露在N端。反应液中过量的Qcyclase能将N端的谷氨酸残基催化形成焦谷氨酸端含有焦谷氨酸的二肽不能作为DAPase的底物,从而终止进一步的切割。反应液进行一轮逆向IMAC,His标签TAGZyme DAPase和Qcyclase酶就能被去除。在流出液中可收集到目的蛋白。目的蛋白N端的焦谷氨酸残基可被His标签pGAPase去除,pGAPase 能被第二轮逆向IMAC去除,在流出液中即可获得纯化的无标签目的蛋白。

Applications

TAGZyme体系提供特异性切割、重组试剂和污染物的完全去除,是制备不含His标签蛋白的理想选择,适用于多种应用:

  • 通过NMR或X射线衍射分析确定蛋白结构
  • 制备治疗性蛋白
Features
Specifications
应用 Production of therapeutic proteins, protein structure determination using NMR or X-ray crystallography
去除标签的效率 >95%
蛋白酶识别位点 Various signals (please see handbook)
特性 Highly specific exoproteolytic activity
标签去除 Exoproteolytic
时间 30 minutes
fragment fix placeholder